蛋白质半衰期怎么测？CHX 法 + 实操指南 | MCE原创

就行，嗯，今天的话主要是给大家讲一下蛋白质的半衰期测量相关的一个知识点，然后演讲的话主要分为三个部分，一个是蛋白质半衰期的概念，以及蛋白质这个嗯，降解的意义，然后再就是研究蛋白质降解的一些常用的方法，然后在最后给大家嗯，放一个我们自己验证过的一个产品的数据，然后可以给大家提供一些protocco，如果大家有疑问的话，也可以交流一下。嗯，首先我们进入今天的第一部分讲解，就是蛋白质半衰期的概念和意义，一般情况下我们提到半衰期的话。嗯，大家可能第一个想到的就是常规的这个半衰期的嗯概念，就是说某一个物质，它在它的数量，浓度或者是活性降低到原来的50%的时候，所需要的这个时间，那嗯，那我们平时接触最多的应该就是一些药物的，或者是蛋白抗体的这个血浆半衰期，特别是动物实验的时候，当我们给药给嗯，就是以某一个浓度去给药物了之后。

嗯。当呃，当，当以某一个浓度浓度去给药，给了之后在血浆当中去检测到血浆当中药物的浓度降低到初始给药浓度一半的时候，这个需要的时间，那我们今天了解的这个蛋白质的半衰期呢，它和我们以往的这个半衰期可能有点不一样，就是蛋白质的半衰期的话，其实更侧重于是在细胞内，然后某一个蛋白质的总量因为降解而减少到原来50%，所有所需要的时间，它其实是一个更微观的概念，就嗯，是指包内的一个蛋白的含量的情况，那最开始。在早些年的时候，就是科学家们都认为蛋白质它的在细胞内的合成是不可逆的，然后是一个稳定的静态的，就是我合成之后，嗯，它就会恒定的存在，然后随着同位素，同位素适踪剂的这个进行代谢标记的这个技术的兴起，然后研究者占就是发现蛋白质它其实是一个动态合成的过程，也就是他是一个不断的合成和降解的一个动态过程。而如今的话，大家已经。

就是达成了一个共识，或者说已经默认细胞质内的蛋白质，它其实是一个持续更新的。一个状态，那么蛋白质它这种就是细胞内蛋白质这个持续更新，或者说它这个降解具有什么样的生理功能呢？对于一个细胞而言的话，我这个蛋白质它的嗯，它的合成的就是合成是否是否正确，然后蛋白质胞内蛋白质某一个蛋白质的含量，以及细胞内的稳态，以及当嗯受到一些外界刺激的时候，我我是否有一些应激反应，其实它都需要嗯包内的蛋白质通过降解去调节一下，以以及应对这种包外的环境的变化，所以。

嗯，放大了来讲的话，蛋白质的降解它其实是与神经退行性疾病也有一定的关联的，那么我们目前主流的就是呃，细胞内蛋白质降解的话，主要包括三个部分，一个是呃，一个是自噬溶酶体途径，第二个呢是泛素蛋白媒体途径，第三个的话就是。嗯，就是这个线粒体内的一个线粒体酶的一个降水解酶的一些，嗯，降解方式。那么我们下面逐渐嗯，逐一了解一下，首先第1个是ROM媒体体系。溶酶体系统的这个降解溶酶体的话，其实它离不讲到溶酶体就离不开自噬，自噬溶酶体它主要是去嗯降解细胞质当中可溶解的蛋白和一些聚集的蛋白，然后自噬的话，它其实是一个很保守的分解过程，主要是由于细胞内的组分周转或者是再循环，就是。

会根据。就就是用于细胞内组分的周转和再循环，然后根据我们这个被降解的组分，它的具体的机制，其实又可以分为微微距式，微字式，分子伴侣介导的字式以及句字式，然后这边右边的这个示意图的话，是一个嗯，姿势过程的一个核心就是。一个核心过程的一个示意图，然后涉及到的一些关键蛋白，嗯，这里就不多展开讲了，那么我们自视溶酶体就是溶酶体途径，除了自试溶酶体的话，它其实还有一个溶酶体，还有一个内体的溶酶体的途径，内体溶酶体途径主要是去分解一些膜蛋白，或者是或者是就是细胞通过内吞以及吞噬途径递送到胞内的一些细胞外的底物，那这个呃，因为我们今天主要是了解的。

这个细胞内的蛋白降解，所以嗯，大家重点关注一下这个姿势溶酶体途径，也就是右边这幅图就可以了。嗯。然后第二个体，第二个体系的话，就是嗯，泛素蛋白酶体的这个系统，然后泛素蛋白酶体的话，它其实嗯，大家先看一下左边这个图，主要是小分子的泛素蛋白，在ATP依赖的条件下，经过三个酶，就是泛素激活酶11，以及泛素结合酶12和泛素连接酶13的一个极联反应，然后这个小分子蛋白，小分子泛素就是这个红色的标记，它会被共价连接到。

嗯，会被共价连接到底物蛋白的耐氨酸残基上，耐氨酸的这个缩写是K，然后这个呃，在这个过程当中的话，一三泛素酶它主它主要是识别底物蛋白中特定的氨基酸序列，然后赋予了这个泛素，呃泛素蛋白酶体系，一个特异的选一个底物的选择性，然后。当第一个泛素分子被加上去了之后，多个泛素分子会进一步的在这三个酶的催化作用下，然后结合到第一个泛素分分子的这个耐氨酸K48残基上，形成一个。K48连接的多泛素，呃多聚泛素链这种修饰的话，一般是会被26S蛋白酶体识别，然后去借到一个经典的嗯蛋白降解途径，但是当嗯当这个加就是。就是，嗯。

当它这个连接类型，也就是我后续的这个，但这个泛素加的位点不一样的时候，比如说加到嗯，K62或者是其他的这些位点上的时候，它其实会呃，蛋白质的这个降解途径的话，它其实是会不一样的，然后。在这个体系当中，它还有另外一个酶，是一个去泛素化酶，它主要是能够识别并且水解泛素与蛋白质底物之间的一个形成的一个液态键，然后从而实现泛素的一个循环利用。嗯。泛素介，泛素介导的这种就是蛋白质降解与，通常是与转录和翻译协同作用的，然后共同调控蛋白质的降解，然后从而确保了这个活细胞在不同的生理和发育发育阶段，它能够快速调节特定蛋白质的一个浓度。那接下来再讲，再了解一下这个，嗯，线粒体降解途径，线粒体的话，它其实最开始起源于内共生，然后虽然说线粒体它是拥有自身的一个基因组，然后会编码一些由线粒体核糖体翻译的蛋白质，但是绝大多数的这个线粒体蛋白，它其实是由核基因编码，然后在细胞质的翻译，翻译过程当中运到，就是在胞质翻译后运到线粒体的，所以线粒体蛋白其实它的降解机制一般也是分为两种，一个是嗯，膜上的蛋白，就是可以通过线粒体相关的途径在胞质当中去降解，同时呢，它也可以。

就是在线粒体当中去被这40多种蛋白酶去降解，然后就是嗯，因为线粒体它其实嗯是可以分为不同的趋势的，然后这个不同的趋势的话，其实也有不同的这种嗯蛋白水解酶，然后这些不同的蛋白水解酶呢，他们就是共同维持着线粒体内部蛋白质的一个稳态，主要是嗯，一个是限制线粒体内短，就是短寿命的一些调控蛋白的一个积累。

因为它主要是行使一个调控功能，调控完了之后其实是需要被降解，如果说这种调控蛋白大量的积累的话，那嗯，某一个信号其实是会被异常激活，那这个时候线粒体的功能其实就是发生了异常，然后第二个就是可以通过蛋白质加工调节一下线粒体当中蛋白的一个活性，当它当某一些关键蛋白出现错误的这个翻译的时候，我及时降解它，然后还原成氨基酸，再去合成一个新的正确的蛋白，然后再就是。再就是当我线粒体发生损伤的时候，会有一些蛋白受损，特别是当ROS被诱导的时候，那这个时候异常的蛋白质就需要被及时的降解掉，也。嗯，然后在这个蛋白酶的，呃，在这个线粒体的蛋白酶体系当中的话，最主要的一个是呃，ATP依赖性的这个蛋白酶体系，然后这些蛋白酶的话，它主要是分布在细胞，就是ATP依赖的这些酶，它主要是分布在细胞膜上，和我们的呼吸链其实是相互作用的，就是相互配合的，然后这些蛋白水解。

这些蛋白水解酶的话，它其实大部分是呈这种圆筒状的一个复合，圆柱状的一个复合物，然后。然后呃，利用他一个保守的这种结构域去水解ADP，然后再去将嗯，将这些就是带。嗯，将这些异常的底物转至，就是异常的蛋白转至蛋白酶水解腔当中去。嗯，前面呢，就给大家嗯简单的讲了一下三种不同的蛋白降解途径，那么嗯。

那么有这么多不同的降解途径，我们在研究蛋白质降解的时候要怎么去研究呢？其实嗯。目前有许多种方法都可以去研究蛋白质的这个半衰期，包括脉冲追踪实验，以及基于质谱的一些蛋白质，呃，蛋白质组的分析方法，这些分析方法的话，各有利各有利弊，主要给大家列举一下，然后来详细的了解一下。其实嗯，蛋白质的它这个降解速率的话，就是符合是是符合一级动力学的，也就是说蛋白质的降解速度与当前的细胞含量是成正比，细胞并不是说等蛋白完全合成以后才决定要不要留它，很多时候它其实是边翻译就嗯边翻，在翻译的过程当中，细胞就已经开始检查新生的这种多肽链，如果发现一些异常的话。那嗯，那这个时候他就会去启动一些降解程序，所以所以这些，嗯，因为它是因为它是这种就是边翻译边去修正的一个过程，那么我们这些检测方法的话，也会有个就是有各自适合的一些呃检测场景。

我们就是逐一来了解一下，首先第1个的话就是脉冲追踪分析这个方法，它主要是，嗯，主要是在我们先看这个图，就是在含有放射性标记的氨基酸，就是将这种放射性标记的氨基酸加到正常培养的细胞当中去，然后呢。嗯，然后然后这个时候就是嗯，培养一段时间之后，这个放射性标记就会标记所有的蛋白质，然后再将将这个培养基换成含有非放射性标记的氨基酸的一个培养剂，那这个时候，嗯，我所有的蛋白其实都已经带上了放射性的标记，然后再正常的培养一段时间，比如说两个小时，四个小时，6个小时之后，我再收集我的蛋白，收集这个细胞，然后裂解之后去得到我的得到蛋白，然后将蛋白裂解液去做WB分析，然后用特异的抗体去分析我不同时间点这个蛋白质降解的一个情况，或者是通过其他的一些。

就是检测这种放射性，放射性标记的方式去，嗯，去检测蛋白的一个降解的情况，然后这个时候我通常需要做两组，就是一个是嗯，一个是去检测我的待测蛋白，第二个是用一些比较稳定的蛋白去作为内参，然后这个时候比这个时候我待测蛋白相较于内参蛋白的一个变化情况，就可以作为它一。就可以判断他的，嗯。就是降解速率，也就是说简单点讲的话，就是先短时间内给细胞打上一个放射性标记的标签，然后再停止这个标记了之后换成普通。

普通培养剂，然后再随着时间，就是不同时间点去采样，然后最终看一下我被标记的这一批蛋白，它的分布的一个情况，但是这个方法的话，它的优点是对于就是正常的细胞，它的生理干扰极小，因为它加入的是嗯放射性标记的这种氨基酸，也就是说它在嗯生物功能上，这个放射性标记的氨基酸是与非非标记是有相同的效果的，所以它对正常的这种生理是干扰，干扰是比较小的，然后。还可以去特异性的检测内源和内和一源性蛋白的一些降解，但是它比较麻烦的点呢，也就是他的缺点，一个是操作比较繁琐，第二个是嗯，因为含有放射性标记，所以很多实验实验室可能不太满足这个。

嗯，就是实验条件，然后第三个的话，在就是它后面分析的时候，如果是用抗体去进行分析的话，那这个时候我还需要有不同的。就是有这种不同的抗体，那也那也就是说我其实研究的话，嗯，还得受限于抗体的这个是否含有目的蛋白的抗体，然后这个方法的话，其实它嗯很难就大规模的去应用。然后在在，而但是这个方法有一个优点，就是它可以呃研究从头合成的一些，就比如说我刚加进去的时候，然后嗯，他和我们下面介绍的一个是有一点区别的，然后第二个方法的话就是CHS。也就是缓缓解酰亚胺，然后用它就是它这个是一个蛋白酶翻蛋白，蛋白质翻译的抑制剂，然后在培养过程当中，我把嗯，我把CHS加进去之后，那这个时候我蛋白质的翻译其实是被阻断了，然后用CHS处理一段时间之后呢，再通过。

嗯，蛋白胶或者是其他的一些检测手段去分析干，看我的目的蛋白的一个降低的情况，然后我们可以平行检测一下，就是嗯，我的检测蛋白以及对照的一个内源稳定性的蛋白，比如说微管蛋白，或者是肌动蛋白的一个风度，然后可以生成，就是可以生成一个，嗯。它它自己的一个降解曲线，就是相较有点类似于QPC的分析，就是相较于。内参的一个降解的方式，然后这个方法的话，他嗯，他的一个他的一个优点就是说嗯操作比较简单，但是它的它的缺点也很明显，因为加入了CHX，它其实是有一定的细胞毒性的，第二个就是它不太适合于长寿命的蛋白，因为有一些蛋白就嗯比较稳定，那我加了它之后，就是我是阻断了它的翻译，但是它会长期存在，可能我6个小时也检测不到它的一个降解，可能需要更长的一个时间，那这个时候就是嗯。

可能并不并不能及时的捕捉到一个合适的时间点，那这那这个时候可能就是实验结果，看起来我加了CS也没有发生降解，就会怀疑是不是CS它嗯，没有效果，这个时候其实是可以考虑一下蛋白质就是嗯。就是研究的这个靶蛋白，它是否是一个比较稳定的，或者本身半衰期就比较长的一个蛋白，那这个可能会出现这样的一个假阳假阴性的情况。然后呢，再嗯，再讲一下这个泛素融合参考技术，这个技术的话，其实嗯，和前面的都不太一样，它其实是基于一个N端规则，就是蛋白质在体内的半衰期其实取决于其N端。

暴露的这个氨基酸残疾，这个残疾的话，一般是可以作为降解信号就是。就是N端的这个氨基酸残基是可以作为一个降解信号被泛素蛋白酶体系识别，然后这个N端，嗯，N端规则也并不是说对所有的蛋白就是天然生效，所以它也有它的局限性，那么在这一个方法当中的话，如果比较简单一点的话，就是直接将泛素构建到带，就是这个涂上绿色的是带色蛋白，黄色的是泛素分子，那我直接将。这个泛素分子构建到嗯，待测蛋白的一个N端，嗯，构建上去了之后，它会。

在最开始合成的时候就是，嗯，因为蛋白质合成的话是先N端到C端嘛，那也就是最开始合成的时候，其实就带上了这个番俗标记。这个时候。这个时候我包内的一些酶就会切，就会将泛素，嗯，就是这个泛素的一些水解酶啊，会把它切开，就是嗯，等比例的生成一个。嗯，暴露N端的这样的一个待测蛋白，然后呢，我再去。我再去检测这种就是。就是这个待测蛋白的一个片段，比如说两个小时或者四个小时之后去减，然后可以判断出它的一个半衰期，这个的话就相当于不带内参的情况，然后下面的这个B图是带内参的情况，带内参的情况的话就是我的泛素分子其实是构建在带侧蛋白的N端和呃内参蛋白的C端之间，那么在表达的时候。

先表达出稳定的。就是稳定的这个内参蛋白，然后再表达出泛素，然后再表达出我的带侧蛋白，然后泛素暴露出来之后，它会被切开，切开之后生成两部分，一个是嗯，就是我的内参蛋白和泛素的C端点在一起，它是稳定存在的，然后再就是。嗯，再就是会生成一个我的目的蛋白，也就是待测蛋白与泛素的N端，因为它N端暴露出来了，这个时候会借到就是泛素蛋白酶体系的一个识别降解。然后这个时候我的。我通过去检测带色蛋白相较于内参蛋白的含量，然后可以判断出它的一个降解的速率，然后这个嗯，这种检测方法，它的一个优点的话，就是可以补偿一样本的差异，嗯，差异来源造成的一个数据变化，再就是嗯，可以检测蛋白在脉冲阶段的降解，就是前面提到的，因为我们蛋白合成的时候是N端到C端嘛，也就是最开始先合成N端的泛素，那也就是。

也就是说，在有一些蛋白质，它是一边合成一边降解的时候，只要它合成了，嗯，就是就是边边翻译边去降解或者修饰的，这样的一个过程也会被捕捉到。而我们前面讲到的两种。就是嗯，特别是CHS，它其实是CHS处理了之后，它其实是捕捉不到这种就是在新生蛋白的降解的一个情况的。嗯，后面再讲一下这个启动子参考技术，这个的话和泛素就是会有点儿像，然后它是可以测量蛋白质片段与长寿稳定的这种，嗯，参考内参的一个水平的比值，其实前面讲到的几几种方法，它都是要涉及到一个内参蛋白的，然后这个启动子参考技术的话，就是将。

我的待测蛋白与内参就是这种长寿命的参考蛋白，勾在同一个起同一个指令上，然后他们共享一个启动子，那这个时候嗯，就是我可以通过嗯指粒的抗性去控制他们的表达，然后加加抗性和移除抗性了之后。移除这移移去这个抗生素了之后，呃，应该是加了这个抗生素之后，它就会，它就会就是脂粒，就相当于会正常的表达嘛，然后这个时候呢。嗯，这个时候它就会同时去生成我的待测蛋白与长寿命的蛋白，然后在生成之后，在后面我去监测它们两个的。嗯，监测他们两个的这样的一个嗯表达情况，去判断他们在就是同时表达之后是否就是嗯，我的待测蛋白相较于内参蛋白是有不同的一个降解的速度的。

但是这个方法其实嗯，操作起来的话也会有一点复杂。然后再就是，嗯，有一些荧光技术，荧光技术的话也会被引入到这样的一个检测当中，比如说蛋白质荧光开关，它就是有一些荧光蛋白可以表现出光激活或者是光开关，光转化的这种特性，然后也就是说我利用不同特不同特定波长的或者强度的光，然后去产生不同标记的蛋白群体，然后在后面去估算它的。嗯，估算它的一个半衰，半衰期或者是合成速度，然后再就是有一些蛋白质荧光计时器，以及漂白追踪实验，漂白追踪实验的话，其实和前面的嗯，就是脉冲标记的话是有一点像的，也是最开也是这个蛋白带有荧光之后，我先进行一个光漂白，光漂白之后呢，它后面再合成的一个过程当中，会呃，或者说会有一个恢复，然后这个时候我通过去检测后续，嗯，后续荧光的这样的一个强度，就是带色蛋白的荧光强度与内参蛋白的荧光强度去比较，就是蛋白的这样的一个稳定性。

嗯。然后这些都是在，嗯，就是单个细胞水平上去比较的，然后也然后因为我们现在研究的时候，嗯，有时候也会考虑到组学研究，就是我不研究这个单个的，嗯指标也要考虑其他的蛋白，或者是想同时去监测多种蛋白的这样的一个降解速率，那这个时候就需要用到一些组学方法，然后嗯。

这里的话主要是介介绍两个技术，蛋白组学的话，它其实嗯，其实就是还是依赖于就是这种标记的氨基酸，它掺入到活细胞当中，嗯，这个使用这种稳定同位素标记的氨基酸，乙与没有就是没有标记的氨基酸，然后进行一个对比，然后可以进行一个风度的定量，嗯，这个silc这这个技术呢，它可以使多组样品混合到一起，它这个就是让多组样品和混合到一起的核心就是在于它使用了不同抗生素啊，不同那个同位素标记的氨基酸，然后使得同一组实验当中多个样品就可以混混到一起去同时分析，然后这样的话就可以消除，嗯，操作过程当中系统误差或者是人为误差，然后可以使用。然后然后第二个就是有一个ah ha AHA的话，它其实是一个含迭氮。

含蝶氮的甲硫氨酸类似物将细胞培养就是培养在含有AHA的这个培养基当中的时候，Ah ha会被翻译系统当做甲硫氨酸整合剂新合成的蛋白当中。然后。也就是说，只有在脉冲阶段，新合成的这个蛋白质会。会掺入这个ah ha, 然后ah ha的这个迭代机呢，可以在后续就是通过点击化学的方式去结合一些，嗯嗯，就是缺基或者是其他的一些标记的这种生物素，然后只然后这样的话，就可以单独的去标记一些，嗯，只有脉冲阶段新合成的这样的一个蛋白质，然后将这两个技术连用的话，我可以同时去研究大量蛋白质的一个降解的动力学，然后也就是说我可以去做一个组学分析，然后看一下我某一个药物处理对包内蛋白质。

降解的一个影响，这个时候我通过主角找到一些差异的蛋白了之后，再去单独分析药物对这个蛋白的一个，嗯，降解，降解或者说稳定性的一个功能，那这个时候其实嗯就有点儿像。时空蛋白组学的这样的一个思路了，嗯。那么前面就是关于它的降解的一些常用的方法的话，主要讲到这，讲到这里，其实这些方法当中最简单的还是最开始讲到的两种，就是脉冲标记，或者说因为脉冲标记涉及到一些放射性元素，所以最简单的其实还是CS。CX的一个检测体系，这个是，嗯，就是大家实验会更多的接触到的，关于这个产品呢。

我们也有做自己的一个验证。这个验证的话，我们用到的是HCT116细胞，然后。这里给大给大家展示一下两个结果，这两个结果的话，其实也是我们现在就是放在官网上的A图，就是展示的是嗯，10μg/ml和100μg/ml，浓度就是CHX处理一下，然后不同时间点两大概两个小时一检测吧。不同时间点，然后去检测两个蛋白的一个降解情况，然后内参选择的是贝塔acting，可以看到就是在嗯，在CHX处理之后大概8个小时，内参其实没有发生明显的降解，但是我们另外两个蛋白的话，就已经有明显的一个降解了，从两个小时开始显著性还是比较强的，然后这个产品我们也做了一个批次间的稳定性分析，也就是说我们的右图，嗯，B图，B图的话是10μg/ml的一个低浓度的情况，然后做了三个批次，也是检测这这几个指标，然后都很稳定的两微，两个小时的时候就已经有了一个很明显的降解，嗯。

关于这个实验的一个，嗯，实验流程的话，嗯，这里大这里放了一个简单的就是示意图。大概就是药物处理，或者是指定过表达某个蛋白了之后，然后我这个时候再加入CHX处理，然后同时做好d Mo对照，因为它是考虑到有一定的细胞毒性的嘛，然后这个然后再去，嗯培养一定的时间去收集蛋白，然后做WB分析，或者或者是通过荧光，或者是通过其他的，嗯，就是image这个软件，或者是graphpad去看灰度值都可以去分析一下蛋白的这样的一个，嗯，统计学的一个。

嗯，差异情况，然后这样实验过程的话，我们呃有一篇推文，然后也有一个就是。也有一个很详细的，我们自己验证的一个proto，如果大家有需要的话，可以直接扫码领取。在这个实验当中有一些注意事项，就是首先蛋白质它的降解速率可能存在着很大的差异，然后前面也讲过，不同蛋白质它其实在细胞内的稳定性也是不一样的，有一些长寿命的蛋白的话，它其实不太适不太适合用这个CHX去做。然后。在就是当当我们要去做CX追踪实验的时候，可以先调研一下，然后再就是它有一些蛋白可能降解的非常迅速，那这个时候我们CHX处理时间可以调整到30~60，六十分钟，然后后续的检测的时间点的话，可以就是更密集一点。

然后呢，再就是不同细胞系它对CHX的敏感度也不太一样。所以在检测。所以在检测后续的，嗯，蛋白质就是降解，就是同一个同一个指标的这个蛋白可能在不同细胞系里面，然后我用相同的浓度去处理的话，都会有一些差别，所以在这个实验的时候，建议大家就是多做几个浓度梯度至少是三个，然后去选择一个最佳的一个观测的浓度和检测的这样的一个时间点，因为嗯，因为像大家一般就是检测的话，就是要么二四六八十。

要么就是十二二十四这样的，所以就是。就是为了更好的更好的遇到自己自自己这个细胞系或者自己这个蛋白的一个检测窗口，就是同时要做不同时间点，以及CX处理的这个浓度的一个差异，或者处处理的时间，然后这个是需要在实验设计的时候，就是预实验摸索一下的，然后再就是细胞本身的传带次数，以及细胞的状态，或者是细胞的密度，都可能会影响到实验的效果，所以在嗯，进行这个实验的时候，大家可以先调整细胞状态，然后让他。嗯，活力以及嗯，或者说就直接使用对数级的这个细胞，然后可能每一次使用的话，这个细胞细胞密度或者细胞数量也尽可能的接近。然后再就是嗯，CHX它是有毒性的，前面也提到过，需要做DMSO的对照，然后在这在配置的过程当中的话，也需要在一个通风良好的环境当中，然后这个药物现配现用，配制的时候要超声助溶一下，确保它母液以及工作液是一个澄清的，澄清透明的状态，然后再去嗯进行实验，因为要避免就是没有完全溶解好，然后去给药，这个时候浓度其实是有差异的，特别是像现在冬天室温嗯比较低的情况下，它可能溶解的。

就是没有夏天或者是常温环境当中融的那么好，特别d Ms so, 有时候也会结冰，从-80拿出来之后，嗯，它可能并没有完全溶解，我们就直接取样去稀释了，那这个时候浓度其实也有偏差，然后再就是对实验结果进行量化分析的时候，因为我们展示的是一个嗯，WB的图，其实条带上面就是两个小时的时候已经很明显了，那如果有一些蛋白，它比如说长寿命的蛋白，它两个小时或者是四个小时。

直接肉眼看条带差异性没有那么大的时候，这个时候我们就是要借助一些软件，比如说image或者是graphpad去分析一下灰度值，然后去看一下它是否具有统计学上的一个显著性差异。然后再就是。嗯，再就是这里也强调了，就是它不太适合一些降解速度慢，也就是长寿命的蛋白，因为它这种处理时间太长的话，CHX的毒性本身也会影响到细胞的状态，这个时候可能内参都会发生了降解，那它就这个实验做出来就不太合适。嗯，今天给大家的分享就到此，嗯，已经结束了，如果大家有什么问题的话，可以在我们的互动区留言，然后嗯，接下来的时间就邀请我们的主持人吧，好的，非常感谢我们石昌斌老师的一个演讲。这是给我们打开了1。