免疫组化攻略大全--从抗体选择到结果分析 | MCE直播回放原创

嗯，大家好啊，非常荣幸啊，能够参加这次的一个直播活动，来跟大家分享，就是我之前做民族化的一些呃经验的一个分享，然后本次呢，准备的内容主要有四部分啊，从我们免疫组化的抗体选择，呃也是我们实验成功的一个关键，然后到免疫组化的方法开发，实际上就是条件摸索啊，摸索到什么程度，我们就可以说这个方法已经是可以了，是一个最优的条件，最优条件的确定标准是什么都会给大家介绍，然后呢，就是免疫组化的结果分析，有定性以及定量或者是半定量分析，都有哪些方法，嗯，也会跟大家分享到，然后呢，就是一些常见的实验问题的一些传播收体。好，我们从第一部分开始民族化的抗体选择。那可能大家在实验室里面做课题，可能开始的一个呃，就是基础可能会不太一样，比如说啊，我们实验室可能已经有了一套呃，既有的方法啊，经过了实验室内部的长期实践，已经是非常成熟的一套流程了，我们从就是往届的师兄师姐那里继承过来的，这个时候他是已经知道了抗体的克隆号啊，稀释比例啊，富裕时间等等的一些条件啊，但是呢，我们已经有了基础，仍然还有啊，以下三点需要我们特别的去注意，来帮助我们更好的啊，丝滑的把这个方法继承过来，首先第一点呢，就是我们信息的完整性与准确性啊，要确认一些关键的信息，有哪些信息呢？包括不限于生产商，也就是它的品牌，然后货号克隆号，克隆性免疫源信息，宿主和物主这些的信息呢，能够帮我们就是精确的定位到当时就是。

前面的前辈用的具体是哪一支抗体，因为有些厂商它可能包括MCE，我们一个靶点可能会上架多个克隆，适用于不同的呃，方法学也好啊，不同的呃，样本种属也好，所以我们一定要知道这些信息，去定位到精准的定位到当时啊，我们实验室用的是哪支抗体，然后呢，就要去查询一下既往的验证数据啊，实验室里面既往比如说做过western blot实验啊，它的条带是怎么样的，有没有非特异啊，啊也不只是查询一次，或者我我们可以多去翻一下啊，它的实验结果是不是稳定的等等，然后有没有做过敲除，敲低的细胞系的阴性对照结果，来确认它的特异性。

然后确认完了信息之后呢，我们要对一个批间差啊，要有一个预知啊，是有一个风险在的，因为不同的生产批次，它的效价和特异性是可能或多或少存在一点差异啊，会导致我们实实验结果突然不稳定，但是我们MCE呢，会对我们上架的产品，就是您拿到手的抗体都是经过了我们内部的一个披金差的一个控制啊，确保您拿到的不同批次的一个抗体，它的效价都是一样的，这样的话就不不用再花费啊太大的精力，我每次买一支抗体都要从头去做一个方法的开发，这样子然后呢，我们预知了风险，那就要来规避风险，如何去规避风险呢？那就要对新批次的抗体进行性能确认，虽然厂家他做了一些呃披肩叉的控制，但是他可能会有在运输途中啊啊，会有一些呃意外情况发生，我们要确保我们拿到手的这个抗体。

底是能用的，然后再用于我们正式的一个实验的呃，样本的检测，那怎样去做这个性能确认呢？啊，可以这样做啊，使用既往的条件，就是之前用什么条件做的，然后加上已知结果的啊组织切片，比如说之前用过了用过的阳性样本啊，阴性样本，把它翻出来去切几张白片，然后用既往的条件再去呃验证重复一下看看啊，新批次的这个抗体染出来的结果跟之前的结果是不是一致的啊一致那说明啊，这个抗体是呃披间XOK的啊，能够通过我们的啊验收啊如果说差异比较大的话，呃，可能需要对实验条件进行一些微调，当然了，如果说我们发现结果跟既往差异比较大，比如说原来是一个呃强阳的样本啊，我们拿到这个新批次之后，做出来是弱阳甚至是阴性，那这种情况可能就要跟厂家做售后啊，我们MC如果说。

遇到这种情况的话，我们会完全给他就是做一个呃，售后处理这个是没有问题的。然后呢，就是库存管理，这种情况可能是属于呃，比如说我们的师姐，呃做完实验文章发完之后，还剩下了半只100微生，剩下50μl放在冰箱里，然后我们的课题也恰好用到这支抗体，可以直接拿过来用，这样的话省去了一个采购货期的时间，对吧？但是我们要预，就是预知一下风险，要避免交叉污染，最好是专人专用，使用干净的这个一液器去去使用啊，这种情况什么时候会发生的，比如说我们在用抑植抗体，前面用的都是没有问题的，可能突然某一天发现，诶，这个抗体怎么突然啊，非特意义比较重啊，或者是做不出来了，很有很有可能就是发生了交叉污染啊，然后所以我们要妥善保存，严格的按照说明书，通常是-20，当然了我们也要去看说明书的一个标志的条件，然后呢，一定要避免它反复动容，也可以进行小剂量的分装，嗯，然后我们mce呢，前两天发过1。

篇关于抗体保存的推文，大家也可以去呃看一下，然后对号入座啊，看看我们抗体应该怎样去科学合理的保存，来延长我们的效期。好，总结一下呢，就是对于既有的方法，关键在于继承与微调，然后充分利用现有资源，但是呢，也要对披肩差保持警惕，有预知这个风险，然后呢，通过严谨的重新的确认和验证，来确保我们结果的一个连续性。

好一个情况呢，是我们实验室有很好的基础啊条件，已知抗体的克隆号括号也是已知，还有一种情况呢，可能我们这也是一个新的研究啊，实验室既往没有一个啊很成熟的方法需要我们自己来开发，但是呢，我们可以通过在文献或者是已经发表的研究中找到，呃，其他的实验室，呃，之前做过这样的一个方法满足我们的啊要求，也就是有已知已发表的证据支持，那也就提供了一个可行性的起点。在这种情况下呢，我们仍然也要注意以下三点，首先呢是文献的批判性评估，然后呢，要抗体信息的一个精确匹配，然后再一个就是实验条件的差异性，我们一条一条来看啊。

首先文献的批判性评估，我们要评估一下这个期刊的影响力，它是不是影响因子高和低，最好我们选用一些呃，高影响力的期刊去查看它的一些使用的方法啊，倒也不是说我们低影响力的啊，呃文章它就不具备可信可信度啊，可能它的实验设计本身就比较简单，但是呢啊，它的实验设计又很科学这个情况，而且它的方法描述的也非常详尽啊，非常具有可信度，也是可以参考的。啊，实验设计是否严谨，然后呢，看一下它的实验设计是否包含了关键的对照，比如说阳性对照，阴性对照，空白对照，这个都是来，呃，以一个批判性的一个角度去判断，文献里面它做出来这个结果是不是经过了一个合理的一个方法的开发啊，这个条件是不是啊，我们可以直接参考的，然后呢，比如说我们本期讲的是每一组画吗？它的结果一般都是，呃，有这个结果图的是不是清晰啊，染色背景是不是干净啊，非特异多还是少，然后它的定位是否符合预期，比如说我们这个方法，这个靶点，它是一个包质定位的一个蛋白啊，它的定位是否符合预期，就是说它是不是染出来确实是在胞质的啊，有些可能非特异在细胞核当中啊，细胞膜当中，然后也发也当做文献发表了，这种情况也是不少的，所以我们要批判性的去评估啊，这个文献当中的方法是不是具有可信度。

再一个就是不仅仅是这一篇文献，我们也可以也去查一下其他使用这个克隆这个抗体的文献，发发表的结果，这样去交叉的去验证啊，然后也可以看一下他们的实验条件啊，有多少差异啊，也给我们提供参考，就是我们拿到这个呃抗体去调整它的条件。然后呢，就是抗体信息的精确匹配啊，这个主要就是呃，来也是来定位那一支抗体具体是哪个货号，克隆号，以及它的一些，比如说有没有带标记啊，啊看一下它描述是否详尽，是否包含了克隆号，货号稀释比例啊，抗原修复方法等等关键信息。一种情况就是有些虽然是相同的克隆号，它可能比如说它的buff份不一样，有的是bic啊，有的是可能带了标记啊，要注意这些信息。

然后呢，参考文献它啊提供的更多的是一个参考，我们自身啊，实验室验证的是最重要的，我们自己做出来的实验结果啊是最可信的，然后我们也要认识到，就是实验条件的差异性啊，有个照搬条件很有可能是呃。就是失败的，可是重复不出来的，我们可以将文献当中的推荐条件呢，作为一个起点啊，而不是说去照搬他的条件，然后以文献推荐条件作为中心，然后在自己的实验室啊去进行优化，然后为什么会有实验条件的差异呢？我们可以设想一下，因为不同的啊，甚至是可能国国内外的实验室，或者国内的南南边呃，中间北方，它的地域性差异，样本来源啊，组织固定的时间，就是样本前处理等等。

都是不一样的，这些也都是会影响我们的实验结果的，对。好，总结一下，对于参考文献当中的方法呢，啊，关键在于借鉴和验证，要我们要像侦探一样审视文献的可靠性，然后呢，要理解它的条件和我们实验室的差异，然后在此基础上进行一个独立的呃，优化和验证。好，前面讲的一般都是已经有基础的可能啊，我们也有，也有非常多的情况，可能我们研究的啊，领域非常的新，确实没有很好的基础文献呢，也呃很少有报道啊，或者是甚至连抗体的选择都很少，我们完全是从头开发，这个时候我们要从哪些方面去呃考量去选择抗体呢？啊，一个是免疫原性啊，免疫源啊，比如说我们做免疫组化样本嘛，它的兼容性啊，免疫源的序列是否是符合研究目的，比如说我们研究的是啊这个蛋白的胞外段，那我们选择的抗体，它的免疫源最好就是包外的那一段氨基酸序列，假设它是包内段，那可能跟我们的研究就是有一个呃偏离，然后呢，优先选择提供了免疫原信息的抗体，就是为了帮助我们去判断这个抗体啊，它是否符合我们的研究目的，呃，如果说，呃，有些厂。

厂家包括MCE，就是呃免疫源信息，可能会涉及到一些商业机密，或者是呃专利，呃没有在我们官网上去进行一个展示啊，这个时候大家可以去联系我们的技术支持或者是销售的小伙伴啊，您可以告诉他您的需求，比如说我要研究的这个蛋白，我的研究目的是什么，我研究的是哪一段来判断，呃，这个抗体是不是推荐推荐用的啊，我们可以给你一个答复，给评估一下，或者是推荐克隆，这样都是可以的。

然后呢，是注意有它的克隆性啊，有单克隆啊，都克隆优先的话，一般是选择单克隆，甚至是比如说兔单克隆，或者是重组兔单克隆，这样的话，它的特异性会更高，甚至披间差也会更低。然后呢，是一个反应物种，比如说我们研究的样本的种属在抗体的反应物种范围内，我们研究的是人的样本，那我们这个抗体的反应种鼠那一定要包括人的啊，如果说它只能识别兔的小鼠的组织，那是就不适用于我们这个人的样本的研究啊，这种抗体也是不能选的。然后呢，就是推荐的应用及析式比例，我们要开发一个每一组化的方法，这个抗体肯定是要适用于做酶一组化的，就看一下它的推荐应用里是否是包含了HC，有没有明确的一个稀释比例，这个稀释比例就是我们参考来进行方法开发的。

然后呢，就是修饰啊，刚才提到了，假如说啊，我们的蛋白它是一个表达风度非常高的，这样可以用一些直接标记的，直接就是呃，没标的一个一抗指标一抗去做啊，假设我们这个表达风度不够高，中等甚至表达很低，那最好呢，还是通过一个一抗二抗的这样一个级联放大的一个效果去组合啊来进行检测。再一个呢，就是种鼠的来源，这个种鼠来源一般是受限于啊，就是二抗的选择，是否有对应的二抗，假设我们实验室里面已经有过了，比如说呃，羊抗兔的一个二抗，那我们在有抗体可选的情况下，一抗可以选一个兔抗，这样的话就不用再为他专门配一支二抗，对这样的话与我们检测系统的兼容性也是比较好的。

好，那我们前面讲了这三部分啊，讲的是啊，我们抗体选择考量的一些因素，我们就拿一个例子啊来看一下啊，比如说我要在人的胰腺癌样本啊，要检测badd这个蛋白，我要开发一个免疫组化的方法，我如何去选择抗体，首先这个呃，研究目的就包含了非常多的信息，我们的样本，样本的种属是人的啊，然后呢，我要检测的靶点是bad啊这个蛋白，然后我们要做一个每一组化的方法。然后再去一一对应，去看哪些抗体符合我们的要求，首先抗体名称bad啊，是是我们研究的靶点啊，可能有一些，呃，不同的厂家，包括MCE，它在选择这个抗体名称，因为它有非常多的同用名嘛，选择了其中一个，大家最好是去看一下，一般这个抗体的信息页面都会有一个swis ID啊，看一下这个ID是不是一样的啊，也避免一些可能他用了其他的同用名，但实际上跟我们研究的这个靶点是同一个蛋白这样子，然后呢，研究的是bad bad这个蛋白啊，做的是人的样本，那我们就看它的反应物种是否是否是包含了人啊，这里反应物种有human啊，也是符合符合要求的，然后我们要开发每一组画的方法，这个时候就要看啊，它的推荐的应用是否是包含了啊每一组画啊，我们看到这里每一组画杠P呢，就是用的是。

PE石蜡包埋的一个呃尔马林固定的一个组织啊，意思也就是符合我们要做每一组化的这样一个要求。其次呢，这里还有免疫源信息，如果说我们研究的是比如说包内段，那我们就看一下它这个免疫源1~50是不是包内段，如果是的话，符合我们的要求，假设1~50是一个包外段，那我们就舍弃掉这个抗体去选其他的，然后还有呢，我们去看它的验证图，因为我们研究的是人的胰腺癌样本，我们去看可以看一下是不是厂家啊，做了这个样本类型的一个验证，我们看到，诶刚好这里也很就是人的啊胰腺癌样本的一个验证，而且看一下它的图啊，肿瘤细胞染色胞质定位非常好，然后间质呢又很干净啊，呃，定位准确，然后菲特也比较小。

这个相当于说是厂家已经做了一个明确的验证啊，是抗体是可以用的，这个抗体的话，我们选来去开发一个方法，它的成功的概率就会比较大。好，这是第一部分啊，我们已经知道了如何去选择抗体，那我们拿到了这个抗体，呃，去做方法开发啊，从它最优的一个实验条件确定的标准是什么呢？啊，因为我们去做方法开发嘛，就是条件摸索，其实每一个步骤都会影响我们的染色结果啊，大概的步骤的话，会有这么1234566个主要的步骤，会影响我们对实验结果的影响，会，嗯。

比较大一点，比如说啊，我们在做方法开发的时候，首先选样本，如何去选这个指控样本啊，我们可以从数据库或者是文献当中啊，文献中用了什么样的阳性啊，阴性样本去选择，选择已知阳性的样本，然后呢，优先选正常的样本，为什么优先选正常的样本，比如说呃，为什么不选肿瘤样本，肿瘤样本也不是不可以选，因为像这种异常的样本毕竟是他跟我们这种就是正常状态下表达不一样，它是发生了异常假设，比如说嗯，刚才的bad靶点，我只是举个例子啊，在肿瘤发生的时候，它是一个异常的高表达，那我们选择了一个肿瘤样本去开发方法的时候，可能。

适用于肿瘤样本染色的条件，我们再去染正常的组织的时候，它可能就会啊，强度会偏弱，是这样子的，所以我们优先选正常组织样本，然后呢是修复方式，修复方式有两方面，一个是它的修复液有酸性的，碱性的，酸性的修复液的它的一个修复力度可能会小一点，碱性的可能会强一点，再一个就是不同的，比如说主肺修复，高压修复啊等等的。再一个就是过氧化物的一个阻断，这个主要指的是，嗯，因为我们的二抗用的是大部分用的是酶标的二抗嘛，就是蜡根过氧化物酶标记的一个二抗，然后如果说内源性存在一些过氧化物的话，它会带来一些非特异啊，尤其是一些含血量比较高的一些组织啊，要进行一个过氧化氢的一个封闭和阻断啊，前期也可以通过我们在取材的时候，把一些血块儿啊剥离，或者是我们在组织灌流的时候啊，把这个血液灌流的干净一点，去去除一些血也能通，也能为我们后面再做免疫组化检测的时候，去掉一些呃非特异的一些影响。

然后就到了一抗，一抗和二抗的一个肤育啊，其实这两个呢，调整的角度呢是很像的，都是抗体，就是浓度梯度啊，富裕的时间以及不同的稀释液也是会影响这个抗体的一个染色效果，然后最后最后呢，就是染显色和复染，比如说我们dab的显色时间啊，有长有短，进行一个时间梯度的一个摸索，好我们现在就呃分享一些小tips，就是我既往在做每一组画当中一些小的心得啊，实验成功的一个呃，可以提高我们实验成功的一个概率啊。碱性修复一般是适合大部分免疫组化检测方法的，嗯，就是比如说我们开发100个呃靶点的检测方法，可能有90%都是用碱性修复能够做出来的，但是也并不是绝对，有一些比较特殊的蛋白啊，可能需要一些酸性修复一个条件，具体还要我们以我们呃就是实际做的为主，但是我们进行方法开发的那个起始条件，呃，可以建议大家先用碱性修复液开始做，然后呢，扁桃体，阑尾和胎盘组织是比较常用的一些指控样本，然后呢就是依抗浓度的影响是比较大的，然后呢就是依抗的富裕时间以及修复条件等等啊，我们可以在。

那个做条件摸索的时候，从这三方面去做一个调整。最后就是如果说我们参考的数据比较少，可以同时选择两到三个克隆去同步开发，互相验证，就是刚才提到的可能呃发表的文献也比较少，可选的这个克隆啊也比较少，那我如何，因为没有参考嘛，我如何去确定我摸索出来这个条件做出来的染色效果是不是对的啊，是不是这个呃抗体它最真实的，这个蛋白它最真实的表达状态，这种情况是未知的，那我们就可以选择呃多个克隆去同步开发，这样的话他们之间有一个互相的印证。

我们还是拿刚才的那个人胰腺癌样本bad蛋白每组化染色方法开发来举一个例子来看一下啊，实战去看一下从哪几个方面去调整我们的热色条件，刚才我们选定的啊，这个抗体是合适的，然后呢，嗯，就来选择我们的指控样本。我们可以从去H，比如说H这个数据库去看一下这个靶点在不同的这个组织当中，它的表达的一个情况，诶可能我这里在啊HP网站上检索了bad，然后查到了他在这种不同的组织当中啊蛋白表达的一个高低，然后呢，我就去选选择一般选择一个，呃。呃，高或者是中等强度的一个，呃，正常组织去作为我们的一个指控组织，去进行后面的条件摸索啊，阳性组织，这个时候我们可以选定人的一个正常的肾脏啊，比如左边这个，它在一个肾小管儿有一个染色，然后像肾小球是一个阴性的，间质也是阴性的，它可以选择胎盘组织，它的一个滋养层细胞，它是有一个胞质的一个着色，嗯，这样子就这样我们就可以预知了，诶这这样的一个染色是正确的，然后我们拿的拿着这两种组织去用这个抗体去做染色。

好，我们首先来看，拿到这个抗体之后，先看说明书，看看说明书推荐的浓度是多少，我们刚才看到的这个抗体，它的每疫组化推荐的浓度是1:50~200，那我们可以去做啊第一步啊的那个单变量实验，就可以去调整一抗的一个浓度梯度啊，厂家推荐的是50~200，那我们可以设置50和200，中间再设置一个100，然后我们刚才提到的可以从碱性修复啊的修复液开始，可以设置一个20分钟，然后二抗的话也是要根据二抗的说明书，它推荐的一个浓度复育时间，我们可以选一个30分钟减40分钟啊，然后复燃一分钟做这么三个啊组去看它的染色效果，好假设啊我们得到这样一个结果，首先看定定位，我们刚才提到BA，它是一个包定位的。

一个呃，蛋白好，我们染色出来，它的定位均是细胞质染色定位准确，那首先我们就得到了这个抗体，它的一个定位是对的啊，是可以的，然后看染色强度啊，这三个组可能1:50，它染色有点强，呃，1:100相对来说比较合适，然后1:200啊，再进行一个倍数稀释的时候是有些减弱的。所以说我们可能更加倾向于在1:100的条件下去做一个后续的一个条件摸索，然后我们再来看特异性，可能1:100的时候，肾小球有非特异，刚才我们在数据库里面查到的啊，肾小球它是一个阴性的啊，肾小管是强染色，这个是对的，然后胎盘的啊，胎盘组织脏层细胞染色良好，好我们拿到了1:100这个条件啊，肾小球有非特异，其他的染色定位啊，强度啊啊都是OK的，那我们下一步就主要来针对这个肾小球的非特异去做一个，呃，条件的一个调整，我们可以从比如说修复时间啊，一抗复裕的时间去进行一个摸索，比如修复时间，我们刚才用的是碱性修复20分钟啊，大家一定要记得，就是在做条件摸索的时候，上一轮我们确定出来的相对来说比较合适的条件，在下一轮条件摸索的时候一定要带上那个条件，为什么呢？因为尤其是可能是。

但是大部分都是手工染色，手工染色它的人为带进来的因素有非常多，实验的披肩差是比较大的，所以说我们把上一个条件带进来之后，可以作为一个啊对照，可以作为一个参考来看一下我们调整的条件，它的一个实际的变化，所以我们先把第一组上面一比，160分钟这样一个条件做进来，然后再在这个基础上，比如说因为它有非特意嘛，那我们就要降低强度，可以把这个碱性修复的一个时间由20分钟变为10分钟，给他减半，其他条件不变。

或者呢啊，可以选择一个酸性修复，它的修复力可能会稍微弱一点，也能够，也有可能会把这个非特异降下来啊，那我们可以把啊碱性换成酸性时间不变，或者呢，也可以在刚才的条基础上，呃，修复条件不变啊，把我们的一抗的复时间由原来的60分钟减半减到30分钟啊，这样看一下它的一个菲特异会不会降下来，那我们来看假设啊，结果在碱性修复10分钟，也就是说我们修复时间减半，然后其他条件不变，1:100负于60分钟的时候，我们这个肾小球的非特异有了一个明显的减弱啊，说明我们的条件调整是有效的，但是呢，仍然弥漫的，仍然有这个弥漫的黄色的着色啊。

同时肾小管的染色强度会明显减弱啊，胎盘滋养层细胞染色良好，什么那意思呢？就是说我们这个把修复条件时间减半的这个操作啊，明显的改变了这个肾小球的非特异，但是呢，并没有改善，那并没有改变我们正常的染色的一个强度，在强度不变的条件下，把非特印给降下来了，是有效的，但是呢，可能观察全片仍然有一个弥漫的淡黄色的着色，那我们可能就有理由推测，呃，这个弥漫性的淡黄色着色有可能跟我们的依抗，呃。

呃，关系不大啊，也有可能有关系，我们接下来就对这个弥漫的红色着色啊，来进行一个啊条件的一个调整，去看看哪个条件更会把这个背景染色给降下来，比如说啊，我们可以去调整二抗啊，或者是显色液的一个富裕时间的一个摸索，或者是更换抗体稀释液，刚才提到的，其实抗体的稀释液对于这种就是弱的背景染色是也是很有效果的，比如说我们在这里。刚才我们想讲到了碱性修复10分钟1:100赋予60分钟，其他条件不变，是上一个定下来的相对合适的条件，好我们第三轮的时候也把这个条件放进来，然后呢去调整，比如说我们可以把这个显色时间由原来的10分钟啊减少两分钟到8分钟，或者是啊，可以把这个一创的一个呃稀释液给它换一下，看看是不是跟稀释液有关，其他条件不变，好我们发现结果更换稀释液也就是这个条件，肾小管有了清晰的啊细胞质染色，肾小球或者是间质的背景干净，那意思就是其实我们这个稀释液呃，影响也是比较大的，更换了稀释液之后啊，非特异去掉了，然后同时其他的染色啊，定位啊，强度都是比较合适的。

那我们最终也就是说把这个条件一个最适的一个染色条件给确定下来了，我们就用这个条件进行我们正式的样本的一个检测，但是呢，也要注意，在我们每次染色的批次啊，要设置一张指控，这个指控是我们系统的指控，是对于整个实验操作操作的一个指控，可以去选择我们之前用过的肾囊胎盘的组织的样本，然后再去设置，呃设置我们的呃检测的正式样本结果判读呢，应该是只有我们的对照啊的这张片子染色正常的前提下啊，其他的啊，样本的检测的结果才可信，为什么呢？因为我们这张指控是指控整个，比如说啊，你的呃抗体的配置对正不正确啊呃修复的，呃修复的条件是不是跟我们条件摸索的时候是一致的，像这种仪器也有可能会发生一些未知的一些影响，对不对啊，这这张呢，就是指控到我们整体实验成功啊。

还是失败的一个一个，呃，标准有可能啊，我们会发现，嗯，指控是正常的，然后其他样本是阴性的，这样我们我们就可以去怀疑我们的样本本身就是阴性的，而不是，而不是说可能是因为我们实验做错了，抗体配错了导致的阴性，对吧。是这样一个目的。好，嗯，我们的方法开发的部分讲完了，最终我们要拿这个抗体，拿这个条件来做我们正式的一个呃结果的一个检测，然后拿到结果之后，我们要对结果进行分析啊，分析有哪些分析呢？啊，这里分享三个，比如说是有定性分析啊，什么情况下用的是定性分析呢？比如说我们在一个呃，举个例子，比如说呃小鼠的呃海马体CA3区进行了一个固表，拿的一个新相关病毒的注射，我们来确认这个抗这个呃病毒注射进去之后，有没有把我们的目的蛋白有了一个固表达，这个时候我们就可以把这个脑组织取材去做一个每一组化的一个染色去看一下，哎，我们海马体的CA3区是不是这个蛋白过表达了，也就是说它的那个信号是不是变强了，相对于其他脑区，或者是比如说我们用6强多巴胺神损伤了神经元的一个效果确认，我们就可以染那个NEUN的神经元的marker，看一下它是不是。

表达减少了，意思就是我们神经元被损伤了，或者是呃，在临床上可能会做有一些辅助诊断的用法，比如说这个细胞的呃，增殖的标志物，KI67或者上皮的标志物啊，去做一个定性的一个分，呃一个分析，定性分析呢，就是有和无是还是不是啊这样的一个分析的一个方法。

还有呢，就是一个定量或者是半定量的一个分析，比如说我们用的H就是组织化学评分啊这样一个分析方法，这个后面我会展开跟大家讲，也是呃，比较好用，非常常用的一个方法啊，再一个比如说我们做肿瘤眼镜可可能会用的比较多的TPS肿瘤细胞阳性比例分数这样一个分析方法啊，大概的意思呢，就是说用我们阳性的肿瘤细胞数啊，比上总的肿瘤细胞数去判断这个阳性的啊比例或者是联合阳性分数，有可能引入了一些免疫细胞等等的一些分析，那定性和半定量分析，定量和半定量分析的这个工具呢？啊，有可能临床上目前用的啊，比较多的还是我们病理医师的一个人工判读，或者是目前也有一些黑楼软件的一个分析，可能科研的小伙伴用的比较多的还是嗯image j这个这个软件，当然以及也有非常多的实验室也都在用这个黑。

软件分析。好，我们就展开讲一下这个HK的一个半定量评分的一个方法，这个方法呢，主要是用来评估把蛋白在肿瘤细胞中表达强度和阳性细胞百分比的一个一个方法，我从定义当中我们就可以看到，它的这个方法既包含了我们的表达的一个强度，又包含了这个阳性细胞的一个百分比，它的计算公式是这样的，大家可能看啊，好长一段公式啊，有点复杂，没关系，我们举一个例子，大家都很清楚了。首先在用H的方法之前，我们要认识啊，有这样四类细胞啊，性，它的一个性的强度不太一样，比如说我们把阴性细胞啊，这是一个细胞中间蓝色的，这个是指的是我们松素染色的细胞核，这我画的一个示意图啊，然后包饰呢，是一个淡蓝色啊，它是如果没有，因为我们第B显色呢，对吧，它是一个黄色的一个信号啊，没有黄色信号，那我们定义成阴性细胞，我们叫它零加。

有那种淡淡的呃，淡黄色的一个染色，我们定义它为一个加，这个是弱阳，然后有中等的染色，比如说呃一个呃，黄褐色的一个染色，我们叫它2个加，像那非常强的酱油色，我们叫它3个加，比如说这张图啊。嗯，大家不知道大家能不能看清，比如说这里就是一个阴性细胞，它的呃染色呃是阴性的，像中间这一块儿，它有阳有阴啊，有强有弱，这块儿可能就存在着一加或者是两家的一个细胞，像这些呃比较染色比较强的酱油色的细胞，就是一个三加染色的一个情况，我们拿到这个视野之后，分别对这四个四种细胞进行一个比例的一个呃预估，比如说我们邻家啊，阴性的细胞有多少呢？在这个视野中可能有个别几个啊，举个例子，它只占1%，好，我们邻家就是1%，一家的像这种非常淡的弱阳性的细胞可能有占个5%，我们这里写5%，呃，两家中等强度的一个黄褐色可能占有45%，这里举例子啊，然后三家非常强的染色可能占49%，然后呢，我们把1×0 5乘以一，45乘以二，49×3。

来做一个加和，得到245就是它的H4构值，那也就是说这个视野我们平分的定量的一个评分就是H4构值，这样的话，我们对于我们实验组每一个，比如说每一只小鼠。进行一个定量的一个评分，他这个评分可以不只是评判一个视野，也有可也可以去评判这个全景，就是整张组织，这个可能是一个20倍镜的一个试验，可以对全片进行一个评分，然后每只小鼠对应一个值，然后我们再对我们的对照组啊，实验组啊及不同的实验组进行一个呃数据的一个统计。

好，讲完了定性定量分析，那我们在术后实验当中可能呃，分享几个比较常遇见的一个问题啊，啊也是我们在呃平时MCE可能收到了大家比如说技术那边反馈过来的大家的疑问比较多的一个地方，在这里做一个集中的分享啊，比如说首先有些同学可能遇到了，为什么我的石蜡切片在染色过程当中脱片了，我们可以从哪些方面去分析，比如说它的样本前处理，是不是我们切完片之后再做烤片的时候，呃，没有彻底烤片，片子还没有干，直接去拿去染色了，这个是会导致托片，或者是我们没有使用粘附载玻片，相当于粘附载玻片的话，它跟普通的就是空中的玻璃载玻片有一个差异，就是粘附载玻片它是带有电荷的，它能够进行一个对我们的组织进行一个吸附啊，更好的将这个组织啊固定在啊玻片上。

或者是我们可以看一下抗原修复是不是过度了，比如说我们有些实验室条件可能是用的高压啊，或者是微波炉煮沸，就像在一个沸腾的水当中啊，煮的时间过久的话，就是我们这个片子贴的再牢，它都有一个脱落的一个可能，或者是我们一炕二炕中间有冲洗的步骤，对吧，是不是冲洗的太剧烈了啊，可能会导致掉片，再一个呢，问题可能是会遇到呃我染色呃有非常高的背景，也就是非特异染色，那我们可以从这几个方面去分析啊，首先前样本的前处理，对于我们的呃染色结果呃影响是非常大的，比如说我们组织固定的时候，脱水不彻底，会出现一个染色不均匀的一个状态，然后呢，或者是组织含血量过多，这个就是刚才提到的，可能内源性过氧化物太多了，影响了我们二抗，在进行那个拉根过氧化膜跟dab反应的时候，跟直接跟组织当中含有的。

这个过氧化物去反应了，会造成一些背景的非特异或者是组织坏死的部分过多。像这种坏死过多，它就会对我们的依抗产生一个非特异的吸附，这个吸附可能是清，一般的清洗步骤都是洗不掉的啊，然看上去就会像是非常高的一个非特异啊，弥漫性的一个黄色的一个染色，或者是呢啊，这个本身我们研究的这个蛋白，它的表达是非常高的啊，分泌性蛋白，这样的话，它可能呈现出来是一个全片的一个染色，对，然后呢，再一个就是抗原修复过度，因个抗原修复嘛，它是暴露抗原的一个一个步骤可能修复过度啊，我们这个依抗可以跟其他的就是非靶标的一个蛋白去进行了一个结合，再一个就是我们一抗二抗复育的时候，我假设本身一抗特异性比较差啊，会产生一些非特异结合，这个时候我们要换抗体啊，假设我们抗体特异性蛮好。

然后呢，它可能由于我们浓度过高啊，会产生一个特异，或者是啊封闭时间不够，会产生一个非特异啊，同时二抗也是一样的，浓度过过高也会有，然后也还有一个比较特殊的，就是比如说啊，我们用的是小鼠的样本，然后呢，我们二抗选的是一个比如说呃阳抗小鼠这个时候它可能会直接会结合到我们的样本上，而不是结合一抗啊，会产生一些呃非特异，这个属于二抗的种属选择错误。还有一个呢，就是。显色剂的浓度过高了啊，拉根木红没在，嗯反应的时候可能会产生了过多的一个呃沉淀的一个堆积啊，看上去像是非特异，这个时候我们就把那个显色剂的浓度给它调低，一般的话，我们用的都是商业化的呃显色剂如果是实验室自自己配置的，这个要呃特别注意一些，我们可以在染色之前啊，先进行一个呃测试，看看我们这个浓度是不是合适的，然后还有一个问题呢，可能啊，我们做出来是没有信号啊，为什么会没有信号呢？啊，比如说我们在样本前处理的时候啊，样本脱蜡不彻底，因为蜡嘛，它是一个输水的一个物质，然后我们的试剂呢啊，一抗啊二抗啊，包括我们的呃修复液啊等等的都是一个水性的，如果脱蜡不彻底的话，因为蜡是输水的，会导致我们的呃，试剂结合不到我们的样本上啊，呈现一个阴性的一个信号。

还有呢，可能组织的本身是没有表达的啊，这个时候呢，我们刚才提到的就是我们系统啊，带的那个披肩指控批次的指控就是非常重要的，我们做了一个阳性指控，阳性指控是阳性的，然后摸索出来我们的正式样本是阴性的，那我们就知道可能它本身是不表达的，如果说我们没有做指控的话，我们染出来的一个一个阴性的信号，我们可能不知道是不是，呃，实验有问题，还是说组织，组织本身不表达对吧。

好，没有信号呢，还有可能是抗原修复不足，抗原修复是暴露抗原的嘛，有一些细胞核的一个蛋白啊，可能需要我们的修复的条件会长一点，碱性修复啊，或者是修复的时间长一点，或者是选择高压修复，在修复不足的时候，它可能这个呃，抗原的暴露的程度呃，会不够，会导致我们的一抗结合不上去，嗯，或者是组织干，偏刚才提到我们的试剂都是水性的，对吧，如果组织干了的话，它可能是会呃结合不上去的，所以说我们在染色过程当中啊，一定要保证我们啊整个过程啊，样本都是湿润的啊，不能干掉。

再一个呢，一抗呢，可能是浓度过低，我们可以去提高浓度，去看一下是不是有信号，或者是亲和力啊比较差，这个时候亲和力差呢，那就建议要换抗体，然后再一个是依抗的配置错误啊，有些可能一次配置很多，呃，抗体的时候啊，因为人为的因素嘛，总会有出错的时候，这个时候我们要进行重复实验啊，或者是后面讲的一抗二抗复的啊步骤，如果产生了干片会导致啊没有信号。或者是二抗中枢选择错误，就是二抗，比如说我们用的是一个呃小鼠的样本，用的是呃兔抗鼠，然后我们二抗选的是比如说呃阳亢和阳抗，比如说阳驼，那那就跟我们的一亢完全不反应，对吧，会是一个阴性的一个结果，或者是显色剂的话，显色剂是不是过期啦，嗯，都会影响，再一个是一个边缘效应，就是讲大家可以看这张图啊，这张图这个组织是不是边边上都有一个啊这种啊DB的一个信号，然后中间是一个阴性的啊，染色不均匀，这个叫边缘效应，这个边缘效应大概率可能会在我们脱水的时候，嗯，组织啊干偏，嗯，然后或者是其他步骤啊，组织干偏干片呢，比如说一抗二抗，我们在富裕的时候加的太少了啊，是要多加一点啊，让它呈现一个鼓包形式的啊，就是包裹我们的样本试剂用量过少。

对，然后我们要放在湿盒里，对吧，保持这个组织的一个湿润。然后我们MC的抗体产品用于美丽组化是有哪些优势呢？呃，首先啊，我们的呃MCE上架的7000多个产品啊，单克隆的占比是呃非常高的，我们有96%的这个抗体，呃都是单克隆抗体啊，单克隆呢它是特异性比较强，然后呢，重组抗抗体占比啊占60%，也是一半多的抗体是重组抗体，重组抗体的话，它的皮间差也是可控的，所以大家在比如说抑制抗体用完了再采购一批，再采购一支的话，即使是我们的呃批号换掉了，我们也可以很好的控制它的一个批间差，嗯，然后呢，我们内部会进行一个多种属多器官上百种组织的一个芯片的验证，数据更加真实完善，这里可以跟大家受两个两个产品的一个内部的一个验证结果啊，包括这里可以跟大家提一下，今天啊给大家推荐的一个抗体清单啊，是我在我们内部。

我选取了一部分啊，都是经过了非常充分的一个组织验证啊，比较推荐大家做民族化的一个抗体。比如说这两个货号，我们是用了呃，像这是呃非常多点对吧，呃的一个不同的肿瘤组织的呃组织芯片去做了一个验证，然后去逐个去分析，因为有些可能我们用一两个样本去做结果比较好，那我们在扩大样本量的时候，它不同前处理啊的样本，它可能会有一些不同的或是不能不太好的结果，我们经过了大量的组织验证证明啊这个抗体嗯是好用的。

那这里也可以跟大家分享一下，我们比如说用到的这样一种特制的芯片啊，比如说我们会有包括人的啊，小鼠的啊，大鼠的样本的一个，呃，不同的，比如说人的有正常的呃，各种器官的啊，以及啊发生肿瘤癌变的对应的啊肿瘤组织，然后小鼠和大鼠的不同的器官的一个，呃，那个组织点啊，放在一张一张芯片上，这样的话，我们这个抗体就是经过了呃不同种属以及不同正常异常的样本的一个验证，都是好用的啊供大家来选择，就是我们抗体用于这个免疫组化，甚至是啊免疫荧光，或者是多重免疫，呃，荧光免疫组化。

染色都是呃，可以信赖的，对，嗯，好，呃，今天的内容就暂时跟大家分享到这里，然后。