深入了解寡核苷酸固相合成的那些技术（一）MCE直播回放原创

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大家如果有任何疑问呢，可以在评论区中提出，我们将在直播后段的答疑环节为大家统一解答，现在那我们热烈的邀请我们的嗯，王老师，上线时间就交给您了。

啊，大家好，我是MCE的产品经理王青青，啊，今天呢，想为大家介绍的内容是关于寡苷酸的固相合成。前面我们的主持人小M也已经提到过，寡甘酸的固相合成呢，是很多，呃，分子生物学的基础，像PCRDNA测序啊，以及基因治疗。希望通过今天的介绍呢，能帮助大家更好的了解寡核苷酸是如何合成的呃，当大家后续有相应的呃需求的时候，可以更好的去明确自己想要什么样的一个寡核苷酸。啊，我今天介绍的内容呢，将从四个部分展开，第一部分呢，是介绍寡甘酸是什么啊，第二部分是介绍寡甘酸固相合成的一个技术啊，第三部分是关于寡苷酸的化学修饰，最后呢，为大家介绍一下我们MCD提供的这个寡苷酸相关的定制服务。

首先还是先来了解一下寡甘酸是什么。瓦苷酸呢，它是一类短链的核苷酸的总称，它是由多个这种核苷酸单体啊，通过磷酸酯键连接而成的核苷酸单体呢，它的，呃，这个结构示意图可以看一下，它是由三部分构成。一个呃，磷酸集团，然后一个五碳糖，嗯，还有一个这个碱基，碱基的话有5种碱基啊，AG c tuu, 这个大家都比较熟悉。

然后这个五碳糖呢，它根据它的这个二撇位置，呃，这个羟基是否脱氧，呃这个呃这里的是否脱氧呢，可以分为那个呃脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，如果是羟基的话。它就是没有脱氧，那就是我们呃说的核糖核苷酸RNA。如果是拖延是轻的话。它就是那个DNA脱氧核糖核苷酸。常见的这个寡核苷酸啊，包括有呃，反义寡核苷酸s irana Mara, 还有核酸适配体等等，这里我们啊简单了解一下这几类寡甘酸它们的一个。结构啊，以以及作用机制。像反一寡苷酸呢，它是一个，呃，单链的核酸链啊，可以由DNA或RNA组成，一般它的长度不会特别长，大概在20个核苷酸左右。

这个反应管苷酸呢，我们是可以将它啊设计啊与靶基因去互补配对。当这个反应寡戊苷酸它和这个靶基的MRA结合的时候呢，嗯，它会去诱导招募这个核酸酶，然后这个核酸酶可以剪将这个MRI给剪切降解掉。从而去调控基因的一个表达。如果这个设计的法乙寡甘酸和。MRA的这个翻译起始位置。结合的话，它就会形成一个空间位组，然后去阻碍这个核糖体正常的组装到这个MRI上，这样呢也可以起到一个抑制翻译的过程。如果我们设计的这个反义寡甘酸，它结合到了一定的，就是特定的剪切位置的话。

这样这个呃剪切呃就呃呃，我们就可以调控这个剪切，然后去表达一个特定的剪切体。核酸适配体的话，它，呃，它同样也是一个单链的核酸链。啊，不过这个一般它的长度会更长一些，大概会有几十个核苷酸长度，像五六十七八十个核苷酸，嗯。是比较常见的，也会有一些核酸适配体，甚至有呃，100多个或者是200个左右的一个核苷酸长度。它最大的不同呢，是这个核酸适配体，它是可以形成一定的三维结构，就类似于我们这个图片当中这种去。啊，形成一个特定，形成一个特定的空间结构，然后呢，通过这个它的这个三维结构去结合一些靶分子，呃，像蛋白或者是细胞，甚至是一些小分子化合物，这与其他类型的寡核甘酸呢，就哦有很大的不同，其他类型的寡甘酸基本都是通过呃碱基互补配对原则和靶基因去结合，而它是通过自己这个特定的呃三维结构去结合。

所以它结合的这个大分子就不是，呃说一定要结合基因，它可能会会结合更多不同类型的一个分子。像SR和ma r大家都比较熟悉了，嗯，他们的呃，结构啊，还有作用机制也就比也都比较相似。像SRA呢，它是外源性的一个小RA。啊，Micro是内源性的，这这两类这个。瓦甘酸小rana呢，它都可以去，呃，诱导这个RNA干扰在细胞里呢，这个形成的短的双链rana会解决，然后其中它的正义链。

可以看一下这个示意图，其中它的正义链呢会被降解掉，然后它的反应链会和其他的一些多多种蛋白，像ago等蛋白呢去组装成一个沉默复合体。然后通过这个反义，呃，反义链呢去靶向，结合这个靶筋。这个沉默复合体。它具有核酸酶的。活性是可以将这个MRA给进行剪切，然后降解掉。啊，麦克呢，它有一点，嗯，特殊的地方就是它能够发生这个。一些情况下可以发生不完全互补配对，就类似于这种示意图的这种情况啊，所以麦克I呢，它它有一些麦克I，它可以有哦多个巴基。同时调控多个基因的一个表达。

它在细胞内的这个作用，呃。就会参与更多的一个呃调控过程。瓦甘酸它的应用呢，主要有呃，两个大的方向。一个是诊断和成像。诊断成像呢，主要就是利用像PCR技术，DNA测序，或者是荧光原位杂交技术，呃，像在疫情期间大家都比较熟悉去呃做那个核酸检测，还有像这个文章当中，嗯。作者设计出了这个，呃，特定结合新冠病毒的荧光探针，然后实现在这个组织样本当中，我们去可视化这个新冠病毒，可以看一下，像这里的白色亮点就是相应的新冠病毒颗粒。

另一个呃，应用方向呢，就是疾病治疗，前面有说说过这个像反应寡甘酸SRA，它们都是可以调控基因表达的，所以呃，当我们针对这个致病基因。去设计它的啊，靶向序列的时候呢，啊，就可以通过调控这个致病基因的一个表达，从而实现治疗的一个效果，目前全球呢，已经有17种寡核酸药物获批上市了，这里这个表格呢，就是罗列了一些已上市的呃寡核酸药物。这些药物主要呢，类型就是转移寡甘酸。或者是SR。也有一些核酸适配体的。啊，不同于传统的我们熟悉的小分子化药。就小分子化药，它是需要和靶蛋白去结合，但是在实际的药物开发过程中呢，有很多的蛋白，它没办法去筛选出。

相应的这个小分子，就找不到对应的这个小分子抑制剂。所以很多呃靶蛋白，虽然我们已经明确它是一个致病蛋白，但是呃难以去开发相应的药物，就是难以成药。但是如果是使用这种。哦，寡甘酸药物的一个设计原理的话，理论上我们是可以针对呃任意一个呃致病基因去设计它的靶向序列，所以寡苷酸药物它的一个将来的应用。也是非常广泛的，可以去针对不同的适应症去开发相应的一个。药物。我们MCE呢，也是一直持续跟踪这些，呃，寡甘酸药物的最新研究进展，然后我们可以为大家去提供相应的一些活性寡苷酸用于。

相关的科研实验，这里是我们已有的几啊几种这个寡苷酸药物啊，有常见的SRA反应寡苷酸都有涉及。我们MCE呢也提供啊SR相关的产品，因为SRA它是可以沉默基因表达啊，在目前的这个科研实验当中呢，是一个一种非常啊重要的工具去研究那个单基因它的。啊，功能。所以我们MCE就推出了这个预设计SRNA套装，我们呢会帮啊大家去啊，针对这个单个靶基因去设计3对啊SR，然后并且提供三对不同的这个对照，阴性对照，还有荧光标记的阴性对照啊，阳性对照。

像这个呃，当你使用这个荧光标记的阴性对照哦，转染进入细胞之后呢，是可以在啊荧光显微镜下去观察这个细胞的荧光。然后就可以确定您您这个SR有没有成功转染进入细胞。啊，阳性对照呢，是我们是呃，针对这个gab DH这个基因设计的。嗯，当你成功转入这个阳性对照之后呢，这个这一组的细胞是可以去检测到它这个GAPDH基因MRA，或者是蛋白水平的一个下降。啊，我们。嗯，是向大家保证啊，如果你使用我们MCE的这个SRA套装的话，如果呃，我们设计的这个3对SRA，您的使用效果不好啊。是没办法达到像啊转转成功下，你的沉默效率达到70%以上的话，是可以联系我们的。

啊，那个技术或者是销售去反馈，我们可以帮你免费重新设计合成。嗯，此外我们也提供像迈克I相关的产品，迈克尔也是今年啊，诺贝尔生理和医学奖的一个获奖主题。前面也说到microi，它的可以有时是可以一个microi调控多种，嗯，把基因的一个表达，所以它的功能也是比较复杂的。我们。啊，我们呢，是专门设计了一系列可以研究啊ma I功能的一些工具。主要分为这4类。就是麦克的模拟物、麦克抑制剂、麦克激动剂和麦克拮抗剂。啊，这4种类别的产品呢，他们适用的场景有所呃不同。

啊，我来简单给大家介绍一下，像麦克爱模拟物的话，它是一个双链的。双链的核酸链。它的序列呢，和内源性的麦克I双链是相似的，可以模拟内源性的麦克I。然后这个ma m, 呃，抑制剂呢啊，它是一个单链的核酸链。这这条链呢，它是可以和成熟的micro链啊，特异性的互补配对的，所以可以抑制这个microi它的功能。啊，需要注意的是这个麦克I抑制剂，它抑制了这个它和呃麦克成熟链结合之后呢，抑制这个成熟的麦I去结合下游的靶基因，所以嗯，你在使用这个抑制剂的时候，需要去检测下游的这个靶基因的表达是否发生了变化。

但是它不会影响正常这个ma克I的一个表达，所以不需要去检测这个ma克I本身的一个表达量有没有被抑制掉，一般是检测不到的，因为它这个并这个micro I抑制剂，它并不会去参与到这个，呃，Micro的一个生成啊，合成的这个过程。啊，Micro I模拟物和micro克抑制剂呢？这两类产品都可以用于细胞试验，需要使用转染试剂，然后转染进入细胞。啊，Micro I这个机动剂，它的序列是和麦克I抑制剂啊麦克I啊模拟物是一致的，也是双链的。所以它也可以模拟内源性的。不过这一类呃激动剂呢，它是呃，另外做了呃特殊的化学修饰，还有末端标记。这个这些化学修饰和末端标记呢，主要是呃，提高这个核酸链它的一个抗核酸酶抗性，然后并且增强了它与这个靶基因结合的一个结合力。

啊，麦克I拮抗剂呢，也是一个类似的情况，它和呃麦克I抑制剂。序列是一致的。然后也是起到抑制麦克的一个作用。然后呃，拮抗剂，它也做了相应的化学修饰和末端标记。啊，Micro克I机动剂和拮抗剂呢，他们都可以用于呃细胞实验或者是动物实验，由于他们做了呃这些化学修饰，还有末端标记呢，他们的稳定性也更好，所以是可以呃在动物实验当中采用一些直接注射的方式去给药，像伪静脉或者是皮下注射，腹腔注射这些方法。

下面了解一下寡核苷酸，嗯，固相合成的一个相关技术。啊，寡苷酸的合成呢，最早是在上世纪50年代啊，有报道是使用了磷酸二酯法实现了这个寡聚二核苷酸的一个合成，此后呢，经过几十年的一个发展，在80年代，然后形成了目前比较通用的这种固相亚磷酸三酯法。嗯，相应的这个，呃，固相合成仪呢，也在同时期面试。所以呃目前使用的这个固相合成方法呢，其实已经经历了很多年的一个呃发展，然后它的这个技术也比较成熟。互相合成呢，它是一种化学合成方法。是使用这种120酰胺单体作为原料，这个是120酰胺单体的一个结构示意图。

可以看到这个呃，单体呢，它不同于呃，我们常见的这个天然的。核苷酸单体。它核苷酸单体当中一些比较容易发生反应的集团都被一些。保护集团所封闭起来。这些嗯保护集团呢，就是可以呃保护这些反应集团，避免他去呃发生一些我们不想见到的反应，在后续的呃互相合成过程当中中呢，这些。保护，保护集团会被去除掉，然后特定的集团去发生反应。可以看到像这边啊。它的一个羟基磷酸集团，以及碱基上的比较容易发生反应的氨基，这些集团都被不同的呃保护集团所保护。

然后固相合成的一个具体流程呢，就是呃图片是1的，它是一个呃不断循环的一个过程，它的合成，呃合成这个序列的方向呢，和我们比较熟悉的生物合成酶催化的这个过程是相反的。酶催化的生物合成呢，它是由呃序列是从五一撇端到三一撇端进行合成的。而固相合成，它是从三一撇段到五一撇段。在反应最开始呢，会有一个呃，第一个这个单体，它会被预先连连接到那个固相载体上。然后呃，会使用像三氟乙酸去脱去第一个这个单体上的，呃。

枪击上的保护集团，脱去这个DMT保护集团，然后暴露出这个游离的物品，枪击集团啊，以供下一步的反应。接下来我们就将第二个呃，这个单体和活化试剂一起注入到这个载体柱当中。在火化剂的催化之下呢，这个之前面游离出来的这个。五一撇，羟基集团就会和磷酸基团发生反应，形成一个磷酸酯键。这个磷酸酯键呢，它不稳定，然后我们需要加入氧化试剂，把它转化，从这个亚磷酸三酯转化为更为稳定的磷酸三酯。这样呢，我们这个呃，序列呢，就从一个变成了两个核苷酸。

由于这个化学反应它的效率不会是百分之百，呃，会有一些没有发生反应的这个羟基仍然是游离出来的，呃，所以我们需要将这些游离的羟基呢，在使用加冒试剂在那封闭起来，如果不封闭的话的话。啊，后面我们再注入其他的这个第三个或者说第4个呃单体的时候呢，这个羟基就有可能去和后面的呃单体上的磷酸基团去反应形，从而形成比如说缺少一个碱基或者是啊两个碱基的。一些杂志类。这个是我们所不想看到的，所以最后在呃，形成磷酸酯键之后呢，我们还需要把啊游离的那个维撇羟基集团给封闭上。封闭完之后，我们再去重复之前的一个呃过程，将这个第二个。

已经连好的单体上的尾撇枪击集团上的保护集团给去除掉。同样的。再再去和第三个单体上的磷酸啊，磷酸基团发生反应。这样我们就从第2个。呃，核苷酸变成了3个核苷酸长度，就这样每个碱基重复一次这个循环，最终呢，就会产生我们需要的这个寡核苷酸。这个就是基本的一个固相合成的流程。