WB实验进阶版技巧_WB实验流程关键点分析原创

那话不多说，本次直播呢，邀请到了MCE的产品经理金晶老师，呃，老师呢，拥有专业的生物大分子结构理论基础知识和实践经验，并且拥有丰富的WB实验经验，但深入了解热点靶标结构信息，可以为您提供专业全面的实验方案和产品使用指导。如果在老师分享的过程中呢，大家有任何疑问可以在我们的评论区中提出，我们将在直播的答疑环节为大家一一解答，那现在让我们热烈的邀请老师上线时间就交给您了。嗯，直播间的小伙伴们大家下午好，欢迎来到我们的MC直播间，然后我们今天的直播内容主要是关于WB实验的一个关键点分析，那么我们今天的嗯直播主要是从以下三个方面呃进行一个非常详细的概括，第一部分呢，就是把蛋白对WB实验的影响，第二部分是WB实验流程关键点分析，第三部分是WB常见问题及解决方案。通过今天我们的一个介绍呢，大大家都会在WB实验中就有一个更深更深刻的一个认识，那么下面我们来开始呃进行一个第一部分。

嗯，在介绍我们的第一部分之前呢，我们再给大家来回顾一下我们的一个WB实验，那么什么是WB呢？啊，WB作物名称是蛋白质免疫剂，就是利用呃，聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测特定样品或提取物中某种特定蛋白的方法，然后它可以通过分子量大小对我们的蛋白进行一个区分，然后再利用我们这个特异性抗体就可以识别到我们这些蛋白的一项技术。那么通过WB实验我们能够得到哪些信息呢？

首先第一个我们可以判断这个样本中，嗯，这个蛋白的有无，第二个就是这个蛋白的表达量的多少，第三个就是这个蛋白的大小，它的位置是在哪哪个呃，哪哪哪一部分，第4个就是这个蛋白的一个时空变化，以及我们的这个蛋白的修饰鉴定，都可以通过我们这个WB实验就可以得到这些信息。那么概括一下我们WB实验的一个实验流程就是，嗯，第一步是蛋白样本制备，然后电容转膜封闭复育，抗体显影呃这几个步骤，那么在进行这几个步骤之前呢，其实还有一部非常重要，那就是对我们的一个靶蛋白的一个信息的查询，就是靶蛋白它自身的一些特性会对我们WB实验也会产生呃，或多或少的一些影响，那么它会在哪些方面对我们进WB实验产生影响呢？接下来我们也会对。

通过这五个方面进行一个非常系统的一个介绍，那么在介绍之前呢，就是给大家分享几个呃，比较实用的一些查呃数据库网站。那么可能有的小伙伴们也就比较熟悉了，首先第一个就是我们非常常用的一个UN数据库，在这个数据库中我们可以查询到蛋白的一个定位，翻译后修饰功能，异构体序列结构等详细的一些关于蛋白的一些信息，这个我们在日常呃可能实验过程中用到的非常多。然后第二个第二个这个呃，HPA数据库，它里面包含了一些正常或者是癌症人体组织和细胞系中蛋白质的一个表达和定位信息，那么在我们实验过程中也会多多少帮助我们，特别是这个数据库在免疫组化方面可能会呃更加有用。

那么第三个就是关于一些磷酸翻译后修饰的一个数据库也可以，呃，也是对我们的这个白信息查询是非常非常实用的，那么呃，直播间其他小伙伴们如果有其他更实用的一些数据库，也可以在我们评论区中分享出来。嗯，首先我们来看一个第一个定位对我们的WB实验有什么影响，首先你要知道你的靶蛋白是定位在哪里的，因为它的不同定位可能首先第一步就会影响到你的一个裂解液的选择，比如说我们常用的一个裂解液就是这个瑞帕裂解液，它在裂解液中相当于是一个六边形战士，就是很多场景下午我们都可以选择这个裂解液，不管这个蛋白定位在全细胞还是一个细胞膜，细胞质其实都可以用到这个瑞帕列检验。

但是也是有一些其他情况下，我们可以选择更适合的裂解，比如说一些可溶蛋白，在细胞质的可溶蛋白，我们选择缺实盐酸，可能它的效果会更好，那么我们举个例子，比如说像这个在我们unpro数据库里面查询到的这个GAPDH，那么它在胞质呀，细胞核，呃，整个细胞。基本上都有分布，那么这个时候呢，我们就用我们这个最常用的这个瑞帕裂解液就是可以的。那么除了这些常规的裂解液之外，还有一些比较特殊的，比如说像分泌蛋白或者是跨膜蛋白，那么分泌蛋白的话，因为嗯，在培养细胞的时候，我们就可能需要加一些药物理，比如说使用这个B抑制分泌，或者我们直接取这个细胞上清来进行检测，相对来说它是我们需要注意的一个点，那么另一方面的话，就是跨膜蛋白也是我们WB实验的一个难点，那么这个时候我们可以尝试就是不主样，或者是设置一个温度梯度，进行一个主样的一个预实验啊，等呃，确定好我们的一个操作之后，再进行一个后续的实验。

那么我们可以以这个膜蛋文膜蛋白为例，然后在这篇文献中呢，这个作者就对膜蛋白如何进行一个裂解，以及裂解的条件，它进行了一个呃，非常多的一个尝试，然后在它得出的结论就是膜蛋白跨膜蛋白加热或者不加热，对我们WB，呃，这个实验结果是影响是非常显著的。

那么首先它第一步尝试的就是用不同的裂解液，就是比如说是瑞帕裂解液和或者是专门用于这个跨膜蛋白的一个裂解液进行了一个测试，并且也设置了这个加热组和不加热组，那么实验结果发现其实不管用什么裂解液，嗯加热组的，它的这个加热组的这个呃效果呃不如这个不加热组的，所以说他发现这个是否加热对这个跨膜蛋白的这个WB实验影响还是非常非常大的，那么接下来他也改变了一些上样缓冲液中的一些成分，发现就是不管怎么改变，嗯最主要的一个影响因素还是嗯是否在，呃是否是否在上样前进行一个阻样，就是加热是它最关键的一个影响因素，所以说结合这篇文献以及一系列的就是这个。

实践经验，我们就建议，如果你的靶蛋白是一个膜蛋白，我们建议就是你先进行一个预实验。就是提取多份蛋白，然后设置一个不加热组，以及设置一个梯度温度热变性，然后经过检测测到一个最佳温度后，我们后续再按照这个实验条件进行后续的实验操作，是最为稳妥的一个选择。然后第二方面就是表达水平，表达水平对你的WB实验会有哪些影响呢？首先我们拿到一个蛋白的时候，我们要确定我们在什么样的样本中来进行这个WB实验，那么我们就要确定我们的样本是否表达我们的这个靶点蛋白，那么刚刚给大家推荐了这个HPA数据库，它也可以帮助我们辅助，帮助我们看一下这个蛋白的一个表达情况，比如说这个runx two这个靶点，我把它呃输进去之后。

然后点到细胞系，我可以看到一个就是表达量的一个柱状图，那么有的就很高，有的就很低，甚至是没有，那么我们在进行实验的时候，尽可能选择一些高表达的一些实验样本，能够确保我们的实验嗯，能够顺利进行下去，如果我们当初样本选择错误，那么后续呃，我们再进行各种努力，其实都是呃呃浪费我们的时间的，所以说这一步一定要确定好。那么第二个呢，就是我们的有一些靶蛋白呢，他在我们的细胞中本身可能是低表达或者是无表达的，但是经过一系列刺激后，可能会增增加它的表达。

比如说比如说我们这个例子，Hi EA这个D诱导因子，那么它在正常氧的一个环境下，它的表达量，它的它的表达就非常不稳定，非常容易降解，你基本上就检测不到了，那么在一个低氧环境下的话，它就会相对稳定的存在，所以说你要检测这个蛋白的话，你一定要就是。就是嗯，让你的这个细胞保持一个低氧状态，或者呢，根据我们的这个文献的一些已经报道的一些文献，可以使用这个d mog呀，D fo, 氯化谷等试剂，呃，然后让这个细胞造成一个缺氧状态，然后我们也可以就是经过加这些试剂之后，嗯，诱导这个hi的这个表达。所以说我们一定要在呃拿呃确定我们的这个样本之后，一定要查询一些数据库或者是文献，来看看我们的这个目的蛋白是否表达，是否需要一些诱导刺激，那么这个也是我们实验中非常关键的。

这个数据库就是我们的这个，呃，这个茶表达的这个数据库就是我们的这个，呃呃，The human protein Atlas, 这个数据库前面的话有那个网站地址，后面的话可以就是再发一下。然后第三个的话就是翻译后修饰，翻译后修饰也会对我们WB产生很多影响那么大，翻译后修饰通常是在我们的蛋白的基因表达以后，通彻会进行一个不同的翻译后修饰，呃，例如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化等。

那么经过这些一系列的呃修饰，经过一系列的修饰酶或者去修饰酶的严格调控，然后我们可蛋白可能会表达一些呃特定的功能，或者是一个呃，一个激活或者非激活的状态，那么经过这些翻译翻译后修饰，首先比如说可能会引起我们的一个分子量大小与预期不符，特别是如果经常做实验，可能会发现，就是如果你的蛋白发生一些糖基化，那它的这个分子量大小就会远远大于预期。第二个就是条带弥散，就是呃，特别是在发生一些泛素化，可能会出现这个就是长长的一个条带的这种现象。第三个就是多个条带，如果呃有多个休日情况的话，也是有可能出出现的。那么特别是有一些蛋白在进行修饰后可能会降解呀，或者什么，它就会产生一个无信号或者是调带弱的现象，所以说如果你的蛋白有翻译后修饰的话，它就会也会对你的WB，呃，实验结果产生就是以下的这项干扰。

那么我们可以看一下，就是首先简单举个例子，就是磷酸化也是比较常见的一种翻译后修饰。那么蛋白质磷酸化呢？主要是由我们的蛋白激酶所催化，磷酸化多发生在这个呃肽链的三氨酸和酸氨酸的羟基上，偶尔也会发生在酪氨酸残疾上。那么这种磷酸化过程呢？受细胞内的一蛋白激酶催化，磷酸化后的这个蛋白质可以增加或者降低它的活性，那么通常我们在检测磷酸化的呃蛋白时，首先第一步在裂解的时候一定要注意加入这个磷酸酶呃呃抑制剂。另外的话，一般我们的磷酸化的这个水平相对来说就会比较低哦，再检测我们磷酸化蛋白的同时，一定要检测一下我们这个本底蛋白，比如说这个，呃，阿尔法卡帕B的这个P65，我们检测它的磷酸化的同时，一定要也检测一下，就是它的本底水平的量是多少，如果它的本底水平就非常低的话，那么你的磷酸化调带可能会更低，并且可能就检测不到的，然后另外的话，因为磷酸化在一般情况在不处理的情况下，通常它的量就是会相对来说是会比较低的，然后经过一些就是刺激处理，可能会增加它的这个表达，所以说我们也可以根据就是查询文献或者是一些数据库看一看，哎，我这个磷酸化是在什么样的条件下会增加一个表达，我们可以根据这个数据库进行一个做一个阳性对照来确保，啊，不是我们实验过程中出现的这个问。

问题。然后再给大家介绍一个翻译后修饰，就是糖基化，刚刚也说了，就是我们糖基化呢，就是在糖基转移酶的控制下，然后将糖分子转移至蛋白质的氨基酸残积上，并形成糖苷键的一个过程，主要发生在内质网中，然后蛋白质经过糖基化的作用，就会形成一个糖蛋白，然后就会增加我们的这个蛋白质的总质量，并且影响它在凝凝胶中的一个迁移速度，所以会可能会形成一个比较大的一个挑战。

然后你看哦，看我们这个lamp one, 那么我加了一些去糖激化了酶之后，它的条带是在45，但是我不去的时候，他就可以他他的条带就出现了，在100K地以上的这个位置。所以说如果你的。蛋白发生糖基化，那它的那它的这个条带大小可能会远远高于这个预期，那么如果他这个时候你可以尝试一下加这个去糖计化的一些试剂进行一个处理，就可以看到它的一个非糖计划的状态，以及呃，它的糖计划的状态，那么我们也可以就是查询相关文献来看一看，就是它糖进化后的条带大概是在哪个位置，所以说我们在检测这些呃，具有翻译后修饰的这一类蛋白的时候，还是建议大家就是呃查询一些文献，或者是保留全膜，尽量不要彩膜，因为你可能就会裁掉你的目的条带。

哦，第4个，第4个就是蛋白的稳定性，这个其实我们在实验过程中其实遇到的就非常多的，嗯，在我们做实验，我们通常都建议呃，大家就是选择这个新鲜样品，但是有的客户他可能就是没有办法每次保证每次都是一样品，是一个新鲜提取的状态，那个这个时候我们一定要注意，就是这个蛋白的稳定性，就是我们蛋白提取后，它其实是一个不太稳定的一个状态，非常会容易降解，并且上失功能，就是你可能会遇到这样一种情况，就是你呃每次呃新鲜提取后，蛋白可能够得到一个非常完美的一个条带。

但是你把这个样品动了一次，然后你第二次再去跑的时候，发现条带就是不一样，有有很多杂带，或者是呃，或者是就是跟之前的结果对不上这种现象，嗯，其实的话就是呃，就是因为我们的蛋白它其实不是特别稳定的，呃有条件的话尽量还是使用这个新鲜样本，并且的话，因为随着我们的保存时间的增加，以及动容次数，可能会使用我们样品中的这个还原剂的组分呃氧化而失效，所以说我们其实建议大家就是尽量不动，如果你动的话，在第二次上样之前，我们建议你就是呃上样前重新组一下样，然后我们再进行一个上样操作这个这个步骤。

好，第5部分，第5部分就是异构体和剪切体，那么我们我也有的时候可能会出现，就是我赋予一个抗体之后，呃，发现有多个挑代，那么这个时候你其实就要尤为关注了，我可以去我们刚刚的提到的这个unport这个数据库，呃，查询一下它是否存在一些异构体，因为异构体它的结构序列亚非常的相似，很有可能会识别到其它的一个异构体的形式，所以说我们一定要确认我们这个蛋白是不是有其他的一个异构体，另外我们要确认一下我们的这个抗体是否识别我们的异构体的这个。这个靶标这个呃，可以在这个抗体说明书上，或者直接询问抗体的一些技术人员就可以得到。

然后另外的一种情况就是我们蛋白质可能存在一些前体的或者激激活剪切的状态，比如说这个case pace3，然后它经过切割之后，可能会形成一些切割带，所以说这个时候，呃，如果你观察到了，就是比你沐浴蛋白小的这些条带情况下，它有可能就是一个切割体，这个时候我们还是建议就是大家就是保留全膜，然后并且查询一些，提前查好一些相关资料，呃，是否你这个蛋白是否会产生一些剪切体的这种现象。啊，那么以上就是我们就是这个靶蛋白是对我们WB实验会有哪些。会有哪些影响，那么接下来的话，我们再来看一下，就是我们在WB的一个具体实验过程中，呃，需要需要有哪些关键点进行注意的。

呃，首先首先第一步还是我们的这个蛋白样本制备，那么蛋白样本制备第一步就是细胞裂解，那么我刚刚也讲到了，就是可以通过我们的一个不同的定位来选择我们的裂解液，那么把我们的裂解液的主要成分就是列一下之后，我们发现其实大部分裂解液都包含SDS催X100和N40，那么它们的粒体强度大概就是SDS大于催X100>NP40，那么这个。含有SDS的呃这些裂解液，可能会认为相对它的裂解溶解能力就会更强，可能会使蛋白变性呀，蛋白得率更高，但是如果像比如说像呃NP40这一些裂解液，它可能嗯对蛋白会更加温和一些，也会保留一部分的蛋白功能啊，这个其实就要根据你的一个实验目的来进行呃一个仔细的一个判断啊，比如说右边的这个，你选择不同的链解页，可能会对你的条带的一个有影响，你看右边的呃这呃这个这篇作者他用了这个瑞帕裂解液和这个NP40裂解液，在相同的处理条件下，他得到的实验就是条带其实是不太完全相同的，所以说你选择呃呃不同的链接，也可能会对你的一个实验结果也有影响。

啊，特别是我们这个瑞排列解也是我们比较常用的，然后它还分为这个强中弱三三个三种类型，那么主要也就是因为这里面的这个NP40垂碳X100和脱氧胆酸钠它的含量不同，分为了一个强中弱，嗯，大家一其实也可以根据自己的一个蛋白的一个溶解，呃，这个这个是否容易裂解的情况来进行一个呃强中弱的一个选择。

那么我们蛋白裂解完之后，就可以进行一个上样开始电泳了，那么我们的这个sdspag电泳，呃，到其实跟我们的蛋白的一个电荷构像和分子量呃三个因素相关的，但是我因为我们的上样缓冲液中含有这个SDS和贝塔球基乙醇，并且经过加热之后，就会把我们的这个蛋白的构象进行一个打开，然后使它变成一个一级结构，所以说这个时候就消除了这个构像对我们这个实验的一个干扰。那第二个呢，就是我们的这个SDS，它携带了大量一个负电荷，基本上也可以掩盖了这个蛋白本身的一个电荷影响，所以说也消除了一个电荷的影一，一定程度上也消除了这个电荷的影响，所以说我们的这个sdspag胶就可以通过分子量来将我们这个蛋白区分。

呃，区分开来，那么首先就是大的分子量的这些蛋白受到的阻力更大，那它就是跑的会慢一些，留在了我们这个胶的上方。那么小分子量的蛋白呢，它受到的阻力就会更小一些，所以说它跑的更快，然后就会来到我们的这个凝胶的这个下方，所以说就是这样根据分子量的大小来进行一个区分。因此我们在进行蛋白样本制备的时候，首先我们要选择这个合适的裂解方法和裂解液啊，第2个就是一定要注意添加我们的蛋白酶抑制剂，这个能够很好的就是保护我们的蛋白不被降解，嗯，第3个如果你是检测含有修饰类的检测的话，比如说你要进行一个磷酸磷酸化的检测，一定要加上磷酸酶抑制剂啊。第4个就是整个过程中一定要注意，呃，低温环境在整个过程中一定要都都使我们的整个操作在至于冰上啊，并且是使用的一个四度遇冷的缓冲液体系中，嗯，第5其实我们建议大家这一步的话，有条件的话一定要设置一个阳性对照和阴性对照，来保证我们的一个实验过程中嗯的一个呃正确性。

呃，蛋白样本制备完之后，我们就可以开始电泳了，嗯，电泳时我们首先要选择就是合适的分离胶，那么我们可以根据就是蛋白的分子量大小选择合适的分离胶浓度，那么比如说呃，比如说我的分子量在10~40之间，那么我就可以选择分离焦浓度为15%的，为什么要选择这个合适的分离焦浓度了，因为它每个分离焦浓度，它的最视分离范围都是呃，都是有一个最视分离范围的，如果你超过这个范围的话，它的分子量可能就会不太准确，比如说你的蛋白是100KD的，然后我选了15%的，那它的分离，那它的分子量很可能就会显示的不是特别正确，所以说为了我们得到的实验结果的一个正确性，一定要根据我们的分子量的大小来进行，呃，进行选择一个合适的分离胶浓度。

那么特别是这儿提醒一下，如如果是自己配胶的话，这个聚丙烯酰胺凝胶呢，聚丙烯酰胺呢，它是一个呃，神经毒素，在操作过程中一定要戴好口罩，带好手套，要保护好自己。那选择完合适的分离胶浓度的话，我们就可以开始准备上样了啊，一般样品我们建议初次上样量在20~40μg，然后我们可以根据我们第一次的实验结果，再看表达量的一个高低来，然后来调整我们的这个上样量，因为需要注意的是，其实我们WB它的检测是有一定的呃限度的，如果你太低的话，它可能就会检测不到，那么你太高的话，其实可能会影响到你实验结果的准确性，因为可以看到我们的这个呃，这个灰度值并不是随着我们的上样量的增加，呃呈一个线性的变化，你可以看到啊，你可以看到这篇文章作者列了，呃作者作者准备了三个蛋白，它并不是随着一个上样量的一个增加，灰度值就从一个线性变化的，它可能有的到一个。

到一个值之后，它就变化不大了，甚至有可能会降低，所以说其实选择一个最视的一个上药量其实也非常重要的，太低的话检测不到，太高的话可能会不太准确。

那么电泳完成之后，我们接下来就可以进行这个转膜操作了，转膜的话就是利用我们的这个电场力驱动蛋白质从凝胶中洗脱到膜上，然后我们为什么要转膜呢？哎呀，其实最主要的一个原因就是为了方便后续的一个。方便后续的一个检测，因为我们的凝胶，嗯，它里面的蛋白在里面容易扩散，可能会不太稳定，另外一个就是凝胶，它非常的脆弱，我们可以能手一动它就碎掉了，所以说我们需要一个固相载体，把我们的这个蛋白更稳定的一个保存下来，所以说我们这个时候需要进行一个转膜的操作。然后我们转膜的时候，通常有两种膜选择，市场上用的比较多的话就是呃，PVDF膜和NC膜这两种，这两种膜都非常的常见，一般来说其实选择任何一种都没有问题，呃，但是他们两个有一些细小的差别，就是大家在使用的时候需要注意一下啊，首先最主要的一个操作上的差别就是我们这个PVDF膜。

在使用前一定要用这个百分之的醇浸泡到秒来进行一活化理这个的一个区别，那样那么像其他结合力啊，其实PVDF膜和NC膜它的对蛋白的结合能力相对来说都是比较高的，然后然后材料的话稍微有也有一些差别，就是PVDF膜儿它的韧性更好，但是NC膜儿的话，它干的时候会比较脆。可能就是如果你后续要进行大量的操作的话，可能呃也是不太方便的，嗯其他的话，其实嗯他们之间的差异的话也呃不是特别大，嗯主要是操作上和一个后续，呃如果你后续是否需要一些复杂的操作，主要是这这两点的一个区别，你可以根据自己的自己的实呃实际情况来进行一个合理的选择。

然后转膜方法，转膜方法我们目前常用的是这个湿转和半干转，那么这两个方法也是各有优缺点，那么首先湿转的话，可能是大家用的也是比较多的，因为它这个转膜方法的话更加的稳定，尤其是我们大分子量的蛋白，因为我们这个湿转它会里面会加入大量的这个缓冲溶液，这个缓冲溶液的话，可以帮助有一个降温，使它在长时间转膜的情况下，呃，更加稳定，呃，因为它转膜可能会产生一些热量嘛，另外就是这个湿转的话，我们可以外部加一些，比如说啊，外加一个冰浴盒给他一些降温，所以说我们有这个呃外部操作空间，呃。

然后它的缺点就是转膜时间比较长，用的缓冲液比较多，那么半干转的话，它的优点就是我们的转膜时间会相对来说比较短，因为它接触的电极的面积也比较大，所以说它的转膜呃速度会更快，然后它也需要的缓冲液会更少一些，但是因为它就是一个半干转的话，它在转膜过程中容易比较容易，可能就是磨干燥，然后导致你磨失败，它相对来说对于你操作要求可能会高一些，呃，一般来说的话，大分子的话更建议我们湿子，那么其他像小分子的话，其实可以根据自身的选择来，呃实实际情况来进行一个更合适的一个选择。那么还需要有注意一些的，就是我们也有，也有小伙伴提问，就是大大蛋白转膜和小蛋白转膜，你需要注意哪些？那么大蛋白转膜一般我们大于100KD，其实基本上大家都可以称为一个大蛋白，然后转膜的时候，我们这个时候，嗯，可以加入就是0.1%的SDS，防止我们这个大蛋白就是沉淀，就是如果它沉，大蛋白沉淀的话，你可能就会在分离胶的孔口就是跑不下来，它就堵在这个上氧口的那个位置，所以说我们可以加入0.1%的SDS，并且把它的这个甲醇浓度降低到10%，或者是更低，都是一样的，都是防止，就是我们大蛋白一个沉淀，那么小蛋白的话。

小蛋白的话，我就是相反了，就是怎么缓冲液中可以不加SDS，并且可以保持这20%的一个甲醇浓度，并且小蛋白呃的话转膜我们要使用0.22微微膜儿的一个。More.

那么我们转膜完之后就可以进行一个封闭操作了，那么封闭呢，主要是利用封闭液中的一些惰性蛋白与膜上的一个空白位置进行结合，来减少抗体的一个分非特异，呃，就我们刚刚举例说的一个PVDF膜儿和NC膜儿，它对蛋白的一个结合能力都是非常强的，刚刚也看了，就是每瓶呃，每位米的蛋白结合量其实都是非常强的，那么通过转膜这项操作，我们就是把这个抗原抗原蛋白转移到这张膜上去了，那么它这个膜上还有非常多的其他孔隙，就是空白位置，如果这个时候不对它进行一个封闭，那么我们后续进行了一个呃一抗二抗的这个复予操作的话，那么他们也会结合到这些空白位置上，因为它一抗二抗也相当于是蛋白嘛，也会结合到这些空白位置上，这个时候你再去显影，它就是那个黑乎乎的一片，呃，非常影响你的实验结果。

所以说我们我们在这一步需要加上一些呃封闭页，然后把它的一些空白位置给他呃给他占上去，然后这个时候呃可能会极大的减少我们后续的一个呃非特异性的一个结合。那么转啊，那么那么封闭液的话，其实我们常用的有脱脂奶粉和BA这两种，其实也都是日常上大家用的比较多的，那么它的操作就是在室温下也摇从呃封闭1~2个小时，或者是4°过夜，其实都是可以的。那么他们两个封闭液其实也是一般来情况，一般情况下其实是都可以的，但是呃，有些情况，比如BA，它里面儿的一成分更单一，可能会造成你的背景会更干净一些啊，但是我们也有也有一些就是文献证明呀和实践证明，就是呃，脱脂奶奶粉里面因为含有更多种类的一个成分，它可能会封闭效果更好一些。

所以说其实我们一般情况下建议大家可以首先就是选择这个呃呃这个脱脂奶粉进行封闭，那当然它也不是就是万能的，就是下面两种情况的话，就还是建议大家来使用这个BA，或者大家就是之前已经适应好了，我的BA效果很好，那么它也是完全没有问题的，我们只是说就是经过一些数据证明，可能呃更多情况下的8点，它可能呃拖着奶粉的效果会更好一些，呃，但是如果你的抗体是生物塑化标记的，或者是你要是检测的磷酸化抗体的话，我们就这个情况下，还是建议大家使用BA来进行封闭的话，规避一些，呃，就是可能会出现的一个影响，但也不是呃。

那么我们封闭完之后，就可以来进行一个复异抗体的操作了，那么复异抗体的话，它有两种方法，一种呢就是直接法，就是直接发，就是我们直接带有没标标记的这个一抗指标，一抗来检测我们的这个抗原，然后呃，然后再进行一个显影操作的过程，那么就是因为它只它这个过程只需要赋予一个抗体，相对来说它的呃操作更加简便，那么那它的缺点就是如果我把一抗上都进行一个美标标记的话，相对来说成本会更高一些。那么第二个就是间接法，间接法就是嗯，间接法就是我先用一个特异性的依靠去识别我的抗原，然后我再用含有不同酶标的，比如说我带有一个HRP标记的一个二抗，我再去去识特异性识别这个一抗。啊，可以看到，其实我们这个一个一抗可以结合多个二抗，那么在这个过程中，它就是有一个信号放大的过程。

可能会使我们检测信号，呃会增强有增强的效果，另外一个就是我们因为这个可以选择啊，不同标记的一个二康，所以说呃操作上会更加的一个灵活。所以说这个直接法和间接法，它也是一个各有优缺点的，我们选择自己合适的方法就可以了。那么选择好我们的这个肤育抗体的方法的话，我们就可以选择我们的抗体了，那么抗体的选择的话，它其实就是简单就是三个三个要素，首先第一个你需要什么抗体，就是抗体的名称呀，靶点呀，或者是别名，第二个就是你要在什么样的一个样本下来进行实验，你的样本是什么总署的，第三个就是你需要做什么应用，那么结合到我们MCE网站上，那就是它的产品名，应用和应用物种，那么经过这三项来确定哪个抗体更适合你，然后就可以选择到自己合适的一个抗，呃一抗了。

二抗的选择的话，它主要是来根据我们的这个一抗来进行选择的，那它的呃呃主要选择因素有两个，第一个首先我们要关注一下一抗的宿主来源，因为我们这个二抗是去结合我们这个一抗的嘛，所以说一定要关注这个一抗的宿主来源是什么，比如说我们现在的样本是一个人的样本。那么我一看就要选择一个抗人的。然后我这个，比如说我这个一抗是小鼠抗人，那这个一抗呢，它的宿主来源就是小鼠，那么我二抗就要选择一个抗鼠的，所以说它就是这么一个逻辑，就是我们二抗的一个选择，一定要根据这个一抗的这个速度来进行选择，一抗是小鼠来源的，我们就选择抗鼠的，一抗是呃兔子来源的，我们这儿二抗就选择一个抗兔的，所以说要看一下一抗的这个速度来源。

第二个的话，它就是一个标记物的选择，标记物的选择一般来说是根据你的实验类型，比如说我们今天讲到这个WB实验，它通常就是要一些没标没标的标记，比最常用的可能就是这个H2P，那么我们就可以直接选择就是H2P，呃，这个欧联的，呃，山羊抗兔或者是抗鼠的这些抗体来进行我们的一个实验。选择完我们一抗二抗的话，我们也要再选择一下我们的一个内参，内参的话，它对于哺乳动物来说是一般是由管家基因编码的蛋白，那么它在各组织和细胞中表达相对恒定，我们需要这个内参作为一个统一的标准来它用它作为一个参照物，那么内参其实它的要求基本上就两个，第一个就是表达量，呃，比较多，比较稳定。

呃，第二个就是他轻易不会受一些因素的影响来进行变化，因为我们在做实验的过程中，可能会经经常要加一些处理呀，比如说一些加药呀，或者一些特殊条件下，就是这个情况下，你的内参药呃是比较稳定的，呃因为我们要在内参作为一个呃归一的标准，然后去判断我们的靶蛋白的一个变化程度，所以说我们内餐一定要就是有一个比较稳定的这个特性。所以说我们可以看到，我们右边也举出了一些，就是在哪些组织中，我们的这个表达量是比较高的，嗯，哪些是比较低的，我们尽量选择就是我们我们的样本这种表达量比较高的，并且是呃，它的表达量不会发生变化的这种内参，那么常见内参有，比如说像这个tube呀，Acting和gab d HR, 呃，它都是比较常用的，像比较常用的一个三大内参吧。

但是我们要注意的是，就是没有那一种内参是适合于所有的组织和细胞的，还是需要根据我们的一个具体情况进行选择，比如说在我们的这个脂肪组织里，就是贝塔acting，它的表达量比较低，其实就是不太适合作为内参的啊，具体的话大家也要根据自己的一个实验样本来进行一个呃挑选。然后最后一步，最后一步就是显影了，然后我们WB常用的一个检测发方法，主要是有化学发光检测，底物显色系统和荧光检测，然后目前比较最常用的就是我们的这个化学发光检测了，它的显色原理就是我们的二抗是被HRP标记的，然后在碱性条件下，我们这个ECL反应液，它可以催化，呃，HRP可以催化我们这个ECL反应液，就是发生一些光信号，然后被我们的成像音捕获就可以得到，得到就是这样的一个呃条带，那么它这个ecr的一个显影方法的话，它有非常多的优势，其实最主要的优势还是它的价格相对来说比较低，另外它也有多种0米级别的一个发光液可以选择，我们也可以对它进行重行一个剥离，再重新复育抗体进行一个检测，那么它，呃，所以说它这个EC2。

呃，这个显影其实还是大家目前显影最常用的一个检测方法，它的劣势的话，其实也是因为它是通过一个霉促反应得到了一个借鉴性哈，有时候可能会受到这个霉素反应的一个影响。所以说如果以上操作大家都能够就是正确操作的话，最后。可能会得到一个类似于这样的一个呃条带。

那么最后一部分就是给大家介绍一下我们WB的一些常见问题及解决方案。然后我们会把常见的这些无信号，条带弱，背景高，多带，分子量异常的这些现象会给大家进行一个分析，然后并告知大家一些的，并给大家提供一些解决方案，那么我们来看一下就是无信号，无信号和带弱，那么我们也是根据就是整个WB实验的这些流程上分析，就是每一步的操作可能会导致了我们这个无信号或者是条带弱的这个现象。那么大家在呃后续的一个实验分析过程中，也可以就是呃呃一步一步的这样排查就可以嗯找到呃就是我们影响我们的一个问题的一个原因。那么首先第一步就是无信号的话，我们首先要看我们这个检测样本，检测样本如果它不表达的话，那么你得到了一个无信号，它的这个这个结果也是一个非常正确的一个实验结果，首先我们要确定我们的这个我们这个样本对我们这个靶蛋白的一个表达的一个信息。

第二个就是呃，蛋白样本的制备，如果我们蛋白样本含量非常低，可能低到我们这个呃，WB检测的一个限度了，那么他可能也会出现这种现象，另外一种情况就是它的一个裂解不充分，我没有充分的把这个蛋白裂解下来，也可能会导致这样一个现象。那么第三个可能就是在转膜中出现的问题，比如说我的我如果使用的是PVDF膜的话，如果我没有激活，那么那么你可能就转转膜的时候就可能有一些问题，或者是缓冲液的一些甲醇浓度不合适，比如说你是大蛋白的话，你呃你的你的那些蛋白。

呃的一些甲醇浓度不合适的话，可能也会影响它的一个检测结果，呃，那么转膜不充分，那就是我根本就没有把膜转到我的这，呃，把我的蛋白转到我的这个膜上，那么我肯定就是检测不到的了。封闭的话，如果我就是过度封闭，封闭时间过长的话，可能会使一些封闭液就是干扰到我的，呃就是呃，干扰到我的一个蛋白检测的一个信号，就可能让我的抗体没有办法识别到我的一个目的蛋白，也会造成这个无信号和条带弱的这个现象。那么还有就是抗体富裕的因素了，像一抗浓度不足呀，一抗二抗它不匹配呀，或者是一抗不识别我们检测物种的蛋白呀，啊像这些内容我们都可以通过我们的一个抗体说明书来进行一个呃来进行一个就是呃呃判呃判断。

最后就是我们的发光液的灵敏度可能比较低，如果我们这个蛋白表达比较低，我们又用了呃灵敏度比较低的一个发光液，那么它可能就会检测不到，这个时候我们可能会需要一些比如说呃超敏啊呃这种这种显影液来进行一个显影操作，那么就是知道了我们这些就是可能造成的影响之后，我们再进行一个对应的呃措施来进行解决就行了，比如说我们这个样本不表达我们就可以。通过一些数据库或者是文献信息来进行确认我们的样本，呃，含量低，我可以就是选择一些高表达的样本，或者是我增加上样量，或者是我，呃，我复集一下这个蛋白，比如说这个是个线粒体蛋白，我把线粒体复集一下，我再进行裂解，那可能会效果会更好，裂解不充分，就我们可以更换一下裂解液，就是更更强效的一个裂解液，嗯，提高SDS浓度啊，或者是我们裂解后进行一个超声破碎呀，可会使我们的这个裂解效果更加。

好一些，然后我们只要根据我们这些问题产生的原因，进行一个相应的一个解决方案啊，之后我们就可以改善我们的这个实验结果。那么第二个就是背景膏，也是我们比较常见的一类，呃这个实验现象，那么首先我们可以看一下，就是我们蛋白的上样量合不合适呀，呃，像这个背景高的原因可能就是它的一个上样量比较低，然后然后进行显影的时候，可能就会把背景显得比较黑，这个时候的话，我们可能尽可能的就是增加一些上样量，嗯，可能就会有有一些改善。第二个就是呃膜是否合适，就是我们说的呃，NC膜和PF膜是PVDF膜其实是呃差别不是很大的，但是相比之下NC膜可能会背景会更加低一些，那么我换一下膜，可能我会对我的一个实验结果有个一个比较好的一个改善。

第三个就是封闭不充分，就是我们刚刚讲了封闭不充分的话，我们的一抗和二抗作为也作为一种蛋白，就会识别在我们的这个膜的一呃空白孔隙上，那么这个时候可能就会造成一个黑乎乎的一片，那么我们针对这种情况，我们就可以增加这个呃封闭时间，优化这个封闭液浓度，或者更换其他类型的封闭液来进行一个呃改变，那么抗体复原也跟刚刚类似，如果我们抗体浓度过高，也会造成这种现象，这个时候我们需要降低一下我们的抗体的稀抗体的浓度，提高它的稀释比。第二个就是在洗涤，我们通过洗涤可以洗去一些非特异，所以说我们可以如果背景稍微比较高的话，可以增加它的洗膜次数，或者是延长它的洗膜时间来进行呃，来进行优化。第3个就是抗体二抗可能会。

与封闭液有一些非特异性的结合或者反应，这个时候我们建议大家设置一个不加一抗的，不加一抗的一个对照。那么显影的过程中，如果你的膜发生一个干燥的话，它也会就是背景比较脏，这个时候我们一定要注意，我的们的膜儿一定不要处于一个干燥状态，一定要就是时刻是也保持一个湿润的状态，浸泡在我们的一个缓冲液体里面的，然后曝光时间注意也不要过长，呃，另外就是在我们整个操作过程中，一定不要就是用我们的手直接摸呃，触碰我们的这个膜，我们可以用一个小镊子呃，夹在我们的这个膜的一角，尽可能不要就是碰到它的大面积。

然后我们第三个再来看看就是多带，多带可能有哪些因素影响，首先呢，第一个就是这个靶点，它是不是存在一些异构体啊，或者是有一些翻译后修饰啊，呃，或者会产生一些二聚体多聚体这种现象，如果是产生了二聚体多聚体的话，我们建议其实上映前就是再次煮沸10分钟。如果是有修饰的话，我们就是查询好它的靶点信息，呃，提前就是呃不要不要裁膜，呃保留全膜这样嗯，避免丢失这个目的条带。第二个就是蛋白样本制备，如果我们的细胞细的传带次数过多，那么它的蛋白表达谱可能会发生变化啊，这个时候我们建议，如果你之前做实验呃，一直是比较好的一个条带，然后后面呃实验条件呃什么都没有变，但是实验结果却发生了一个偏差，那么我建议你就是再去复苏呃，当初那个传带次数比较少的一个细胞株作为一个对照，看看是不是你的一个蛋白表达谱发生变化了，所以说我们嗯，如果是呃刚刚我说的这种情况的话，大家就可以用这个传的次数比较少的一个作为一个对照来看一看。

然后就是蛋白降解，降解的话它也可能会发生一个多代现象。然后我们一定要就是尽量就是使用一个呃新鲜样本，并加入一个足量的一个蛋白酶抑制剂。然后封闭不充分，也跟刚刚刚嗯那个背景高类似，我们这个时候只要调整我们的封闭液，延长封闭时间，特别是像这种多代啊背景高，其实封闭是非常关键的。那么抗体富裕也是跟刚刚一样，如果你浓度过高的话，它可能就会影响一些非特异，我们这时候降低我们的抗体呃浓度呀，或者富裕时间，并且延长洗涤时间啊，都对我们这个改善和特异都是比较呃比较好的。

那么当然如果我们的抗体不是特别特意的话，也会产生一个非特异调带，如果你更换抗体的话，发现这个效果大大改善的话，可能就是这个抗体它也会呃识别一些非特异条带。第4个分子量，分子量变化，那么第一个刚刚讲的就是这个翻译后修饰，呃，如果我的蛋白经过一系列的翻译后修饰，特别是糖基化，糖基化可能影响比较大，另外就是磷酸化也会有一些一点点的影响，嗯，没有糖基化这么明显，但是它可能会都会引起我们这个条带变大这种现象，这个时候我们也是刚刚也提到了，就是嗯，查询我们的这个数据库或者是文献，看看是否存在翻译后修饰，我们提前做好一个，呃，一个实验预期。

然后如果是呃有糖基化修饰的话，你可以用一些去除糖基化的一些试剂处理之后，看看糖基化调带，呃，看看是不是你的条带可能恢复到呃，就是理论大小啊，第二个就是可能会形成一个多聚体，如果你的条带它是倍数增加的，那么它可能就是形成一个多聚体，如果是这个时候的话，我们建议就是延长这个组样时间。第三个的话就是每个蛋白它的因为氨基酸组成的不同，可能会携带的电荷是不一样的，呃如果我们这个蛋白它如果是呃带正点的话，可能会呃对他的一个电泳呃产生一个阻力，可能会条带会稍微变大一些，这个时候我们也可以就是查询一些资料，看看我们这个拔电呃是不是对条带有影响。

第4个就是异构体或者是剪切体，如果你产呃，如果你这个靶标它存在异构体或者剪切体的话，那么它可能也会有变大变小的这种情况。第5就是我们的胶的分离焦浓度不合适，刚刚也说了，它每个浓度的这个分离焦，它的一个最势分离范围是不同的，我们一定要根据它的最视分离范围来选择一个合适分离，合适浓度的一个分离胶，嗯，这样才能保证我们的一个结果的一个准确性和正确性。那么最后一个蛋白降解，蛋白降解呢，它可能会导致我们的一个分子量降低，或出现多种条带，这种现象就是大家一定要就是呃，注意一下，尽量使用这个新鲜样本，并且加入这个蛋白酶抑制剂。那么还有一些就是其他情况下，嗯，就是大家也比较常见的一种现象，有的比如说第一个这个微笑条带，微笑调带的话，它整体其实影响可能不是特别大，它主要是原因可能是因为你的呃电压调的过大了，它导致它的迁移速度过快，然后里面产生的热量比较高，然后这个时候其实我们只要就是降低一下我们电泳电呃电压的一个大小，降低我们电压的一个大小，并且用一些呃遇冷的一些缓冲液，就可以对我们这个微笑调带有一个比较好的一个改善。

第2个脱尾的话，这种现象可能就是你的样品中还有一些不溶的呃物质，呃可能是你在呃离心吸取上清的时候，吸到了一点的那个沉淀，所以说我们我们在进行实验过程中，我们的样品一定要充分溶解混匀之后，然后再上样，也是尽量使用这个新鲜新鲜样本，然后降低我们的蛋白上样量，使用这个新鲜配置的一个电泳缓冲液。第3个像这种条带粘连在一块儿这种现象，其实最主要的原因就是你的上样量比大了，这个时候只要减少上样量就会很好的改善，另外的时候我们的胶一定要呃。

一定要提高这个胶的质量。第4个就是我们的这个膜上有这些黑点点，这个主要原因就是你的封闭，呃，封闭液它没有充分溶解，里面有一些不溶的颗粒，所以说会造成这些黑点点，所以说我们在实验前一定要提前配，配置好我们这个封闭液，保证这个封闭液是充分溶解的，并且尽可能的就是每次都现用现配我们这个封闭液，有条件的话，甚至可以把我们这个封闭液进行一个过滤处理，保证的就是一个溶解的一个状态。那么第呃第5个就是像这种条带泛白，那么这个时候可能就是我们的洗眼液把我们的这个底物消耗了，我们呃，这种现象的话，可以就是你先就是大量洗涤之后，看看它的在显影，看看它是否能够正常，那么在其他处理上，我们可以减少这个蛋白的一个上样量，在复液的时候降低这个一抗和二抗的浓度，并且稀释我们的显影液。

然后降低这个显影时间。像最后这个，像这个空泡，就是我的条带，其他都是非常正常的，然后中间有一有一个空泡的这种现象，这就是你在转膜的时候，制作这个三明治的时候，呃，中间有气泡没有改进，然后因为气泡不导电，导致你的蛋白没有转运到这个膜上，那么我们一定要注意，就是在转膜的时候，尽可能的操作时候不要有气泡，最后有一个感膜的这呃感感气泡的这个操作就可以避免这种现象。

那么像其他的一些WB常见问题解决方案的话也可以，呃，关注我们这个MC抑制剂的公众号，然后我们里面有也是有比较详细的一个讲解的。最后最后给大家详细呃再简单介绍一下我们这个MCE的检测抗体，MCE的话，我们进入这个MCE官网之后，然后呃点击这个所有产品，可以看到我们的一个抗体的一个呃入口，然后点击之后可以看到我们的一个抗体类别，目前的话我们CE有三千七千家这个抗体，然后包含了目前基本上所有的一个热门靶点，呃并且我们现在主要的一个抗体类型就是重组抗体，大家都知道重组抗体它的一个呃最大的优势就是披肩差异性非常的低，并且生产非常的稳定，特异性也非常高，可以看到我们其实重组抗体。

体的占比几乎达到了90%，所以说这也是我们的MCD检测抗体的一个呃显著的一个特特色，如果大家有需要的话，欢迎大家就是呃来我们sce进行一个选购，那么下面我们就把我们直播间再交还给我们的小M啦。那非常感谢我们老师的精彩分享，这上人受益匪浅，那接下来到小M的时间啦。各位小伙伴们，MC呢多年以来一直致力于生物活性分子的研究，服务于全球的生物医学研究以及药物发现领域的优质顶尖客户，其优秀的科研成果已经发表在包括CS在内的49000篇生物医学和新药研发科研文献中。MC呢在全球范围内也拥有超过了6000家的合作伙伴，不仅有世界嗯知名的医药企业和顶尖的高效科研机构嗯，MC呢也深度布局多个产品线，不仅有活性小分子蛋白、大分子多肽核酸试剂盒等常规产品，也包含ADC protect等特色产品，可以根据您的需求为您的科研提供一站式的药物筛选服务。听到这里，小伙伴们是不是已经抑制不住自己想做实验的销售啦？那MC也将祝您一起攀登科研高峰。

那我看评论区的小伙伴也是对本次分享讨论的，嗯，首先第一个问题是这个250KD以上的蛋白转膜条件的细节是如何设定的呢？请老师回答一下，嗯，像250KD以上这个蛋白的话，它就明显属于这个大分子量的蛋白了，那个这个时候我们推荐大分子量蛋白的话是呃，使用这个湿转的话是比效呃效率比较高的，那么呃，刚刚我们也讲了，大分子量蛋白的话，甲醇浓度可以设置低一些，我们刚刚提到了可以就是采用10%甚至更低啊，你可以根据效果，甚至5%都是没有问题的，然后可以在转膜缓冲液中加入0.1%的。

SDS也可以提高我们的这个转膜效，嗯，效率。然后我们的转膜时间的话，像250K以上的这些大分子的话，我们建议通常建议的话，大家可以选择这个湿转的，然后横流，呃，例如可以选择300mA，然后转膜时间的话，这个可以看一下，就是你的不同的一个仪器操作，一般来说这么大的一个分子量转膜时间大概需要呃2点儿5，甚至三小时，嗯，可以具体参考一下你的这个仪器的这个标准。

好的，那下一个问题是想问一下老师，呃，大蛋白是使用恒压还是恒流呢？需不需要低电流过夜呢？大蛋白的话，我们建议大家选择这个恒流模式，也虽然恒压也是一个比较常见的一个实验，呃操呃参数，但是在实际操作过程中，我们电压过高，可能会导致我们的热量增加呀，呃烧焦呀等问题，所以说更推荐大家就是采用这个恒流模式进行一个转膜操作。好，那下一个问题是，嗯，可以同时转大蛋白和小蛋白呢？嗯，实验的条件是如何设置呢？嗯，这个这个其实我们要参考一下，就是我们刚刚说的，每个不同的分离胶浓度，它有一个最市的一个分离范围，嗯，如果是相差特别大的话，其实不太建议，但是如果都在我们这个呃范围内，其实是可以的，嗯，实验条件的话。

如果是有小，既有小蛋白和也有大蛋白，我们也是更加推荐这个湿爪。好的，那下一个问题是想咨询一下老师，PVDF膜和NC膜的区别是什么？嗯，刚刚刚刚也有一个表格列了一下，就是PVDF膜和NC膜的区别，嗯，它的一个在操作上的一个最主要的区别，就是PVDF膜在使用前需要用百分之百的一个甲醇进行一个激活处理，那么像其他方面的话，像价格的话，就是PVDF膜的话，它会稍微贵一些。然后对于蛋白的一个结合能力，其实这两个膜的话，呃对蛋白结合能力都是比较强的，当然PVDF膜会更胜一筹，嗯，那么在机械强度和化学相容性的话，其实是PVDF膜的话，它的效果会更佳，然后NC膜的话，它可能质地呃在干的时候会比较脆，所以说呃，他们的呃大概区别的话，一会儿也可以再参考一下我们刚刚那个表格。

嗯，好，那下一个问题是磷酸化蛋白一定要用bic封闭吗？嗯，在进行磷酸化蛋白检测的时候，呃，其实不同，呃其实对封闭液的影响的话，其实也是有的，呃，刚刚讲的话，其实我们推荐磷酸化蛋白。可以选择这个BSA封闭，因为这个呃脱脂，脱脂奶粉里面的一些酪蛋白可能会对我们的一个检测有一些非特异性的一个干扰，但是这种干扰也不是一定存在的，我们只是为了避免，就是后续的一些可能出现的一些问题，所以说我们呃推荐大家使用B呃对推推荐大家使用这个b sa来进行呃实验，当然如果你之前进行实验，如果拖着奶粉没有问题的话，那使用它也是没有问题的，我们只是呃说可能会存在这个干扰现象。

好的，那下一个问题是想咨询一下WB在什么情况下会过度，会封闭过度呢？嗯，这个要结合我们具体情况，可能你使用不同的一个抗体啊，或者是不同的靶点，它可能会有不太一样的一个效果，一般来说我们建议的一个封闭时间的话，就是呃，室温1到两个小时，或者是四度过夜，如果比如说你在室温封闭了一呃一下午可能就会封闭过度，呃，另外的话，这个。呃，这个如果你对这个封闭条件不太放心的话，我们可以同时进行，就是两个封闭条件同时进行，比如说呃，拖着奶粉或者是BSV同时这个进行，看哪个效果更好，后续我们再采用哪个呃封闭方法来进行实验。

好，那下一个问题是。嗯，下一个问题是，为什么NC膜比PVDF膜的背景更低呢？那么NNC膜的话，它是呃，这个清水性的能够自然的与水性的溶液相互作用，因此它这个NC膜就不需要我们这个甲醇进行一个预处理，另外这个NC膜呢，它的蛋白质结合主要是依靠缩水作用和氢键作用，这种结合方式就会使它的背景染色相对于PDPVDF膜来说更低，然后PVDF膜呢，因为有较强的这个缩水性，然后需要我们用甲醇来降低它的表面张力，所以说更容易被水性转膜缓冲液子更浸润，提高我们的转膜效率，并且我们PVDF膜它的结合能力对蛋白结合能力也会更大一些，所以说它可能会比NC膜的背景会稍微可能会高一些的这种现象。

好的，那我们下一个问题是，嗯，我们下一个问题是依抗常温育好，还是四度过夜效果比较好呢？呃，一般来说的话，一抗的话，我们是建议大家进行一个4°过夜，呃，封闭的，因为4°过夜的话，它可能会更稳定一些，因为我们的抗体可能在常温时间下保存的时间不会特别久，所以说我们可能更建议大家。嗯，4°封闭，呃，不对，4°服雨过也。好的，那下一个问题是重新煮样的话，不会加速蛋白的降解吗？就是我们蛋白在制样完成之后的话，它里面的一些呃还原还原剂组分可能会随着就是冻成次数的增加失效，就是这些还原剂是很容易进行一个氧化失效，那么这个时候呢，我们蛋白可能会就有一个变性到负性的一个过程，所以说我们可能需要就是呃蛋白呃在上样前重新组样。

然后重新使我们蛋白处于一个变性状态，这个时候，呃，这个时候再去上样的话，可能就不不会再出现就是蛋白聚集的这种现象，所以说我们建议上映前再进行一次左样操作。好的，那嗯，再来讨论几个问题，嗯，小伙伴问他的蛋白是150KD的话，可以选择多大的分离胶呢？嗯，这个可以参考我们刚刚那个表格，其实对于150KD的话，8%甚至6%的一个分离胶浓度都是可以的。

嗯，下一个问题是某个分泌型蛋白只能用快速封闭液才能富育发光显出，那用B达bic或者牛奶都发不出来，这是什么原因呢？嗯，只能用快速封闭液，那可能是可能是BC或者牛奶里面有一些，呃，溶解不完全或者是。存放时间太久，这个用新鲜新鲜配置的封闭液的话，应该来说没有问题，可以再试一试，就是是不是应该不会是因为嗯，只可能是这个快速封闭液能孵出来，其他两种孵不出来这种现象。嗯，好的，那下一个问题是，嗯，想让老师简单讲一讲，这个检测磷酸化蛋白需要注意的点是什么呢？呃，磷酸化磷酸化蛋白的刚刚也说了，就是它磷酸化的这个条带套检测的话，相对来说是比较难的，首先我们在进行一个样本处理的时候，一定要加入这个磷酸酶抑制剂，并且全程都在冰霜，特别是检测磷酸化的这个情况，呃，我们尽可能一定要使用这个新鲜样本，其实有很多次的一个实践，嗯证明就是我使用新鲜样本可以做出来这个磷酸化条带，但凡是我动容一次，可能就检测不到这个在磷酸化的这个，呃实验上是更为明显的，所以说首先样本处理上我们一定要。

加入这个磷酸酶抑制剂，并且是使用这个裂解液，一定要加入这个磷酸酶抑制剂，并且呃使用这个新鲜样本，那甚至在呃，那么上样量的话，上样量的话，因为这个磷酸化它的程度通常来说是比较低的，我们就旧可能的加大我们的这个呃上样量就是如果我们的这个看我们的这个分离胶的这个孔，它能呃承受承受多少，我们尽可能把我们蛋白进行一个浓缩，然后呃上上去来帮助我们检测，可能检测到这个磷酸化的这个条带。

然后像。抗体的话，抗体的话就选择一些就是磷酸化特异，就有磷酸化特，嗯，那个识别特异性的这些抗体就可以，那么封闭液的话，我们也是刚刚也是提到了，其实磷酸化的检测，我们建议就是大家使用这个b sa封闭啊，并不是说这个B不能使用脱脂奶粉，只是说使用这个脱脂奶粉它可能会产生一些非特异，那么我们为了规避这种麻烦的话，其实建议大家来使用这个b sa.嗯，那我们最后一个问题，嗯，想请问老师，可以用乙可以用乙醇来代替甲醇吗？啊，这个应该说的是转膜的时候，这个PVDF膜儿激活的这一步吧，其实有些，呃，我们是可以用这个乙醇来代替甲醇的，相对来说它但但有些实验证明乙醇的效果没有那么好，这个其实可以根据自己的一个具体实验来进行一个测试，因为一部分人说这个乙醇的话，替代是完全没有问题的，但是可能效果嗯没有甲醇那么好，如果对你的实验没有影响的话，是完全可以替代的。

好的，那我看评论区还是有非常多的小伙伴提了很多比较，嗯，比较这个实际的问题，那我们今天也是时间有限，答疑环节就到此结束了，那也非常感谢老师今天的精彩回答，那各位呃，没有回答到问题的小伙伴呢，可以把你的问题发送给我们的直播小助理，或者是我们微信MC1制剂微信公众号的平台，那我们也会有专门的技术知识为您解答您的问题，同时也有比较专业的这个呃产品的推荐给您，可以帮助您的实验快步达到想要的结果。

那非常感谢老师的精彩分享，也感谢每一位参与本次直播的观众，本次直播即将结束，想要观看回放的朋友可以关注我们MCE公众号，在后台回复MCE直播可以会给您弹出这个直播回放链接，也可以关注我们的MCE视频号所有往期直播的回放内容以及非常嗯优质的这个实验类的视频和相关的产品信息啊，会在我们的呃视频号上有回放的，那也可以登录我们的MC官网，找到我们的右上角活动中心中的萌家学堂板块，嗯，看到我们所有的往期的直播以及回放内容，同时别忘了关注我们的小红书账号MC中国，每月都有精彩纷呈的福利活动等你来参与啊，也即将会给大家上线我们春节的活动，希望大家敬请期待，那如果你有任何关于产品咨询和定制的需求，以及关于MC产品售前售后的问题呢？还有相关的合作事宜，欢迎随时通过以上的联系方式来联系到我们。

嗯，再次感谢大家的参与，那我们下次也就是我们年后的直播再见啦，各位小伙伴们再见。