手把手教学WB实验步骤技巧原创

WB实验怎么做？小M带你来了解western ten blot全过程包括制样、电泳、转膜、封闭、抗体、肤浴、显影六个步骤。虽然步骤看似繁琐，但莫慌，小M将亲自上阵，手把手带您操作一遍。本次实验所需试剂如下，实验开始前，请提前将离心机4°C遇冷后续实验全程低温操作首先在re帕列解液中加入蛋白酶抑制剂，混匀后至冰上备用，取出提前收集并清洗的细胞至冰盒上，加入RI盘裂解液，冰上裂解20分钟，然后12000RPM离心10分钟，离心完成后取上清至心的。

离心管中根据BCA试剂盒说明书对上清进行蛋白浓度定量。接下来向样本中加列解液和四成上样缓冲液，将样品调整到合适的浓度100°C，煮样10分钟后放置冰上备用。根据所检测的蛋白大小，提前准备浓度合适的蛋白胶。将蛋白胶置于电泳槽模具上短玻璃板的一面槽内，压紧固定，放入电泳槽。将提前4°C遇冷的一层电泳缓冲液灌入电泳槽内，内槽注满外槽加至电泳槽1/2处，使用干净的枪头上样，分别加入5μl蛋白marker和15μl蛋白样品。加样结束后，盖好电泳槽盖，遵循红对红、黑对黑原则。接通电源前检查正负极是否正确。电泳时，上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源，将电压调到80伏，约30分钟后在秀芬兰进入下层胶时，调120伏高压恒压电泳，当秀芬兰指示剂到达胶底边缘。

船附近时停止电泳。接着用甲醇激活PVDF膜，浸泡10~15秒后转移至一层转膜缓冲液中，同时将滤纸浸泡在一层转膜缓冲液中。电泳结束后，取出凝胶，用切胶板切掉上层凝胶，下层胶放置一层转膜缓冲液中用于后续转膜。

在磁盘内放好胶加，透明面朝下，从下到上依次按照海绵滤纸、PVDF膜凝胶滤纸、海绵的顺序放置，用玻胶片擀净气泡和上交加放入转膜槽中，交加的黑面对槽的黑面，交加的透明面对槽的红面。在电转槽外槽中放入冰盒，倒满遇冷的一成转膜缓冲液后开始转膜。接通电泳仪电源，设置恒定电压75伏开始转印，转印时间根据目标分子量的大小决定。将转印好的膜放入5%脱脂牛奶中，放置摇床上，室温封闭1小时，按照抗体说明书稀释一炕摇晃混匀。

将稀释好的一炕倒入孵浴盒内，摇床上室温敷浴1小时或4°C过夜。一抗敷浴结束后，倒掉一抗，加入一城TBST，在摇床上洗涤3次，每次5分钟。按照抗体说明书稀释二抗，摇晃混匀。将一炕敷浴盒中剩余的TBST倒掉，加入稀释好的二炕，摇床上室温敷浴1小时。二炕敷浴结束后，倒掉二炕，加入一成TBST，在摇床上洗涤3~5次，每次5分钟。

接着在避光的条件下配置ECL工作业，将buffer a和buffer b1:1比例混合，用镊子夹住印记膜边缘，将膜从洗涤缓冲液中取出。擦干膜表面的缓冲液，将ECL工作液均匀滴加至印记膜，室温敷浴1~2分钟，呼育结束后，快速将膜置于化学发光成像仪中曝光显影。以上就是WB实验全流程操作，小M中心祝大家发文章美投必中，做实验皆呈阳性，此外，MC还特别推出暖冬季抗体净爆六五折活动狂欢盛宴指道2025年1月15日快来抓住这波科研福利，更多WB相关抗体请在MC官网查询，还能扫码观看WB相关推文，了解更多WB实验技巧，记得点赞关注哦。