武汉大学殷昊团队开发了一种高效、快速且经济的方法制备高质量的化学修饰pegRNA和epegRNA

研究背景

    绝大多数致病性等位基因源自特定的DNA序列变异，包括插入、缺失和碱基替换，这些变异需要精确的基因编辑技术来纠正。先导编辑（Prime editing，PE）作为新一代基因编辑技术，无需双链断裂或供体DNA模板，即可在人类细胞中实现靶向的插入、缺失以及所有12种碱基转换及其组合的编辑，克服了CRISPR/Cas9系统和碱基编辑技术的局限。然而，先导编辑的应用受到编辑效率不高和递送系统限制的挑战。化学修饰的sgRNA因其稳定性提升，已被广泛应用于研究和被FDA批准的临床治疗。与之对应，化学修饰的pegRNA也被应用于先导编辑的RNP和RNA递送中，但其编辑效率仍远低于预期。高质量且化学修饰的pegRNA对于RNP和RNA递送至关重要，然而，pegRNA的序列长度过长（约125-145 nt），尤其是引入evopreQ1基序的epegRNA（约170-190 nt），不仅合成难度很高且成本昂贵，导致合成的质量差并且难以广泛使用。因此，如何高效制备高质量的修饰pegRNA成为先导编辑应用的关键挑战之一。

研究结果与展望

    武汉大学殷昊教授团队采用RNA连接技术，克服了化学合成RNA的长度限制。通过优化连接条件，成功制备了高产量、高纯度的化学修饰pegRNA和epegRNA（即L-pegRNA和L-epegRNA)（图1）。这种方法生成的L-epegRNA在多种细胞系及两种原代细胞中表现出显著的编辑效率。与通过IVT生成的epegRNA相比，L-epegRNA在RNA递送系统中的编辑效率提高了数百倍。此外，L-epegRNA大幅提升了RNP递送系统中的编辑效率。先前研究表明质粒递送PE能够实现很高效的基因编辑。然而，本研究发现，与质粒递送PE相比，L-epegRNA介导的RNP递送PE显示出更高的编辑效率。

图1. L-epegRNA连接示意图

    与此同时，本研究固相合成了全长的化学修饰pegRNA（S-pegRNA），并与通过连接策略生成的pegRNA进行了对比（图2）。结果表明，S-pegRNA和L-pegRNA在PE2和PE3编辑中表现相当，证明连接方法未损害RNA的生物学活性。L-epegRNA则表现出远高于S-pegRNA的效率，尤其在长片段插入中表现出显著优势。

图2. 连接pegRNA的编辑效率

    通过采用三段连接策略，研究者成功合成了210 nt和234 nt的化学修饰epegRNA，并在RNP和RNA递送系统中实现了高效的17 bp和40 bp插入。这些长度的epegRNA无法通过传统化学合成直接获得，这一突破展示了L-epegRNA在精准编辑领域的广泛应用前景。

    综上所述，本研究开发了一种高效、快速且经济的方法来制备高质量的化学修饰pegRNA和epegRNA（即L-pegRNA和L-epegRNA），不仅拓展了长链RNA的合成能力，还为先导编辑系统在治疗及其他领域的应用奠定了基础。

作者简介

    武汉大学医学研究院研究生雷薪霖（博）、黄安慧（硕）、陈迪迪（硕）和王雪镔（博）为该论文的共同第一作者，殷昊教授为独立通讯作者。殷昊课题组长期专注于基因编辑和核酸疗法，取得了系列原创性成果。

《自然-生物技术》Nature Biotechnology

Rapid generation of long, chemically modified pegRNAs for prime editing