AbMole 稳定同位素篇丨 L-Glutamine-13C5（L-谷氨酰胺-13C5）：代谢流分析示踪剂，在肿瘤谷氨酰胺代谢与还原性羧化研究中的应用

摘要：L-Glutamine-13C5（L-谷氨酰胺-13C5，AbMole，M66414，CAS No.：184161-19-1）是五个碳原子全部标记 13C 的稳定同位素谷氨酰胺示踪剂。其经谷氨酰胺酶（GLS）脱氨生成 13C5-α-酮戊二酸进入三羧酸循环后，可通过质谱同位素峰分布（isotopologue）解析氧化性与还原性羧化两条通路的通量分配。作为肿瘤代谢流分析（MFA）的核心示踪剂，U-13C5 谷氨酰胺在还原性羧化、谷氨酰胺成瘾与细胞代谢重编程等方向的研究中发挥重要作用。

一、L-Glutamine-13C5的分子作用机制

L-Glutamine-13C5（L-谷氨酰胺-13C5，AbMole，M66414）的五个碳均替换为 13C，理化性质与天然谷氨酰胺一致，能被细胞正常摄取与代谢。其示踪机理如下：同位素标记的谷氨酰胺经 GLS 生成谷氨酸，再经转氨酶或 GLUD 生成 α-酮戊二酸（α-KG，M+5）；随后沿三羧酸循环氧化代谢时，经琥珀酸、延胡索酸、苹果酸回到草酰乙酸，与未标记乙酰辅酶 A 缩合生成 M+2 柠檬酸，并生成 M+3 天冬氨酸——此为氧化性通路的特征谱；而当 α-KG 经 IDH1/2 催化发生还原性羧化时，生成 M+5 异柠檬酸与 M+5 柠檬酸——此为还原性羧化的特征谱。通过 LC-MS 测定柠檬酸、苹果酸、天冬氨酸等代谢物的同位素峰分布（M+0、M+2、M+3、M+5 占比），即可定量两条通路的相对通量，灵敏度远高于单纯的检测代谢物浓度。由于 13C 无放射性、无衰变，标记产物在实验全程保持稳定，且质谱分辨率足以区分各同位素峰，使其成为代谢流研究的经典且常用的示踪剂。

术语小解

M+2 柠檬酸是碳稳定同位素示踪代谢流分析中的质谱检测概念，并非一种独立的商品化化学试剂。天然状态下的柠檬酸全部由碳‑12 构成，记为 M+0，而 M+2 柠檬酸代表柠檬酸分子骨架中有两个碳原子被重同位素碳‑13 所替换，分子量相比普通柠檬酸增加 2 个质量单位，在质谱负离子模式下对应的特征离子为 m/z 193。该物质一般不会直接外源添加，多是细胞、线粒体在摄入碳‑13 标记碳源之后，经三羧酸循环代谢生成的同位素异构体。科研人员通过液质或者气质检测样本中 M+0、M+2 以及其他同位素异构体的相对丰度，就能够解析三羧酸循环运转效率以及回补通路活性，用于评估线粒体中间代谢物的周转情况。

二、L-Glutamine-13C5在细胞层面研究中的应用

在细胞层面，L-Glutamine-13C5（L-谷氨酰胺-13C5，AbMole，M66414，CAS No.：184161-19-1）具有广泛的应用。以人胶质瘤 SF188 或肺癌 A549 细胞为例，以 2~4 mM L-Glutamine-13C5替代培养基中未标记谷氨酰胺，处理 6~24 h 后淬灭、萃取，LC-MS 检测三羧酸循环中间体同位素峰。有学者利用该示踪剂证实转化细胞（发生恶性转化的细胞）的谷氨酰胺代谢远超蛋白质与核酸合成需求，大量碳源进入三羧酸循环；还有研究证明在缺氧或 IDH1 突变背景下，细胞将谷氨酰胺通量从氧化方向切换至还原性羧化方向：常氧下 M+5 柠檬酸占比不足 10%，缺氧 0.5% O2 或 IDH1 突变条件下升至 25%~50%，生成的 M+5 柠檬酸进而用于脂质合成，支持细胞增殖，这一发现重塑了人们对三羧酸循环方向性可塑性的认识。还有研究进一步利用L-Glutamine-13C5（L-Glutamic acid 5-amide-13C5）揭示，在线粒体丙酮酸转运受损时，谷氨酰胺氧化成为维持三羧酸循环与细胞存活的主要途径。

术语小解

淬灭指的是快速终止细胞内部正在进行的酶促代谢反应，防止取样之后细胞还在继续发生代谢物转化，避免 ¹³C 标记的碳骨架继续重分布而造成检测结果失真，一般使用低温有机溶剂快速处理细胞，瞬间灭活胞内各类代谢相关酶，冻结当下时刻的细胞代谢组状态。萃取则是淬灭完成之后，通过有机溶剂水相体系把细胞内极性小分子代谢物从细胞沉淀当中提取释放出来，把柠檬酸、α‑酮戊二酸这类 TCA 循环中间代谢物溶到液相中，去除蛋白、核酸、细胞膜碎片等不溶性杂质，制备得到可用于 LC‑MS 或者 GC‑MS 上机检测的代谢物样品，后续就可以测定 M+2 柠檬酸等各类同位素异构体的丰度，分析谷氨酰胺驱动的线粒体代谢通量。

三、L-Glutamine-13C5在动物实验研究中的应用

目前，L-Glutamine-13C5（L-谷氨酰胺-13C5，AbMole，M66414，CAS No.：184161-19-1）的应用已从细胞实验拓展至体内的肿瘤或其它模型的代谢解析。有文献报道，在荷瘤小鼠（皮下异种移植瘤）经尾静脉留置导管恒速输注L-Glutamine-13C5（参考速率约 0.25 μmol/min，连续 2~3 h），小鼠处死后迅速取肿瘤、血浆与正常组织，液氮淬灭后可以用于LC-MS 分析，以解析小鼠肿瘤部位的代谢与正常组织代谢之间的差异。还有研究在 Kras 驱动的肺癌原位模型中利用 13C 示踪比较了肿瘤与正常肺组织对谷氨酰胺的依赖差异，发现肿瘤对谷氨酰胺通路的利用显著高于邻近组织，且环境条件（饮食、缺氧程度）可重排其代谢依赖。体内示踪的关键价值在于避免培养条件的人为偏差：培养基中谷氨酰胺浓度远高于血浆，长期培养会造成代谢表型漂移，而原位示踪反映的是生理微环境下的真实通量。此外，L-Glutamine-13C5（L-谷氨酰胺-13C5，L-Glutamic acid 5-amide-13C5）也能用于肝类器官及外植体培养体系的代谢研究，为代谢靶点验证提供接近动物体内状态的证据。

四、L-Glutamine-13C5（L-Glutamic acid 5-amide-13C5）相关细胞实验（文献参考举例）

该方案适配谷氨酰胺氧化与还原性羧化通量分析。

细胞系：人胶质瘤 SF188 或肺癌 A549 细胞

检测指标与方法：以含 2 mM L-Glutamine-13C5的 DMEM（无丙酮酸、无未标记谷氨酰胺）处理；6~24 h 后以 80% 预冷甲醇淬灭，提取代谢物；LC-MS 检测柠檬酸（M+2/M+5）、苹果酸、天冬氨酸（M+3）、谷氨酸（M+5）同位素峰分布；计算还原性羧化占比（M+5 柠檬酸/总柠檬酸）。

给药浓度：2 mM（可设 1、2、4 mM 梯度）

处理时长：6、12、24 h 时间梯度

参考文献：Metallo C M, et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature, 2011, 481(7381): 380-384.

*注：上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献调整。

五、L-Glutamine-13C5相关动物实验（文献参考举例）

该方案适用于体内肿瘤谷氨酰胺通量的原位分析。

动物模型：C57BL/6 或 BALB/c 小鼠皮下异种移植瘤模型

给药配制：L-Glutamine-13C5溶于生理盐水，尾静脉留置导管恒速输注

给药剂量：参考输注速率约 0.25 μmol/min，连续 2~3 h

给药方案：输注结束后立即处死，取肿瘤、血浆与肝组织，液氮淬灭；甲醇萃取代谢物，LC-MS 分析组织同位素峰分布，计算肿瘤相对血浆的标记富集系数。

参考文献：Davidson S M, et al. Environment impacts the metabolic dependencies of Ras-driven non-small cell lung cancer. Cell Metabolism, 2016, 23(3): 517-528.

*注：上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献调整。

总结

综上，L-Glutamine-13C5（AbMole，M66414）以 M+2 与 M+5 同位素峰的清晰区分能力，成为解析三羧酸循环方向性、还原性羧化与谷氨酰胺成瘾的重要示踪剂。

*本文所述均为科研试剂，仅供科学研究参考

参考文献

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[3] Metallo C M, Gameiro P A, Bell E L, et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature, 2011, 481(7381): 380-384.

[4] Mullen A R, Wheaton W W, Jin E S, et al. Oxidation of α-ketoglutarate is required for reductive carboxylation in cancer cells with mitochondrial defects. Cell Reports, 2014, 7(5): 1679-1690.

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[6] Davidson S M, Papagiannakopoulos T, Olenchock B A, et al. Environment impacts the metabolic dependencies of Ras-driven non-small cell lung cancer. Cell Metabolism, 2016, 23(3): 517-528.