转录组day2

fastQC

Per base sequence quality

fq文件中每一个位置上的所有read的碱基质量值的一个箱式图

Per Tile Sequence Quality

显示了每个tile的平均质量的偏差。冷（blue）颜色质量值好，热（red）颜色表明质量差。在下面的例子中，你可以看到某些title的质量一致性的差。一个好的结果应该是全蓝色的。

Per Sequence Quality Scores

每条序列的平均质量值的密度曲线图；好的数据质量会呈现一个偏的拖尾分布，表示绝大分read平均质量值都落到Q值高的部分

Per Base Sequence Content

每个碱基位置上：ATGC含量的分布图；碱基类型分布检查用于检测有无AT、GC分离现象,由于RNA-Seq所测的序列为随机打断的cDNA片段，因随机性打断及碱基互补配对原则，理论上，G和C、A和T的含量每个测序循环上应分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线。

Note：

由于Reads 5’端的前几个碱基为随机引物序列，存在一定的偏好性，因此会在碱基分布图中出现前端波动较大的现象，属于正常情况。

Per sequence GC content

GC含量分布图：此模块测量文件中每个序列的整个长度的GC内容，并将其与建模的正态分布的GC内容进行比较。

Note：人类物种GC含量范围：40%-60%

GC含量异常：可以排查数据中是否存在大量的核糖体rna序列，核糖体rna序列过多意味着测到的数据中有效数据含量少，不能满足后续分析

Per base N content

N含量分布图；N表示不能识别为ATGC中的任何一个碱基，为未知状态，碱基质量值Q值为0

N含量越多，说明数据质量越差

Sequence Length Distribution

read长度分布图：表示测序read的长度分布密度曲线图；

rawdata 一般所有序列都是一个固定长度

过滤后的cleandata 的read 长度较短占比过高时应该考虑rawdata中数据是否存在大量接头，导致过滤后数据短片段占比过高，此时存在文库构建失败问题

Sequence Duplication Levels

序列重复性分布图；重复率过高提示该样本文库多样性少，即测得的read种类少，获得的基因序列有效信息少，可能影响后续定量准确性。

转录组数据：本身存在一定的read重复，qc报告非常容易出现警告或者红色xx，应该看具体的重复率，但重复率不应该过高比如超过70%。

Overrepresented sequences

过表达的reads

可能存在的情况：（原始数据存在接头的可能性高，可以看过滤后的数据qc报告）

1.来自高表达基因的片段，具有生物学意义

2.来自污染序列，导致文库中的这个序列比例异常高

3.文库检测到的序列多样性不高，重复率高

序列异常排查方向：

1.随机抽取fq文件中的2000条read，去NCBI做 blast比对，看是否有污染其他物种

2.过表达的read序列去做blast比对，查看其来源

3.过表达的read序列与文库构建的接头对比，看是否是接头

Adapter Content

接头含量，表示序列中两端adapter的情况；软件内置了四种常用的测序接头序列， fastqc 有一个参数-a可以自定义接头序列

trim_galore

技巧：用ParaFly并行任务，给你的分析提提速

ref：https://mp.weixin.qq.com/s/Tfo4kqKChJjk2ZHdsWjyuw

任务暂停：Ctrl+Z

只对直接运行的任务有效，后台任务无效

① 提交任务：bash trim.sh

② 按 ctrl+z

终止任务：Ctrl+C

只对直接运行的任务有效，后台任务无效

① 提交任务：bash trim.sh

② 按 ctrl+c

终止任务：kill

kill -9 %num：num为jobs命令返回ID

kill -9 PID：ps fx或者htop可得到PID任务编号)

① 提交任务：nohup bash trim.sh 1>trim.log 2>&1 &

② 使用 ps fx或者 htop 或者 jobs得到任务ID

tips：

bg %number 任务挂后台

fg %number 任务挂前台