eLife：人类和小鼠大脑解剖结构中性别差异的神经影像学对比

摘要：体内神经影像学研究已经确定了人脑中几种可重复的体积性别差异，但这种差异的原因很难解析。虽然小鼠模型有助于理解性别特异性大脑发育的细胞和机制基础，但还没有尝试正式比较人类和小鼠的神经解剖学性别差异。解决这个问题将为使用小鼠作为人脑性别差异的比较模型提供批判性的启示，并提供对哺乳动物脑容量性别差异保守程度的见解。在这里，我们使用结构磁共振成像对人类和小鼠大脑的性别特异性神经解剖学进行了首次神经成像比较研究。与之前的发现一致，我们观察到，在人类中，男性的总脑容量明显更大且变化更大，这些性别差异在小鼠身上没有反映出来。在控制了总脑容量后，我们观察到60个同源区域的性别体积效应大小存在适度的跨物种一致性。通过结合两个物种中基因表达的区域测量，我们发现在体积性别差异中具有更大跨物种一致性的皮质区域在2835个同源基因的表达谱中也显示出更大的跨物种一致性。这些发现有助于确定小鼠中存在的性别偏见的大脑解剖结构，这些结构在人类中被保留、丢失或倒置。更广泛地说，我们的工作为小鼠性别特异性大脑发育的机制研究定位到最能呼应人类性别特异性大脑发育的大脑区域提供了实证基础。

1. 引言

人类在患病率、发病年龄和大脑相关疾病的表现方面表现出许多性别差异。早发性神经发育疾病，如自闭症谱系障碍、注意力缺陷/多动障碍、抽动秽语综合征和语言障碍，往往对男性的影响不成比例。抑郁症、焦虑症、饮食失调和阿尔茨海默病等青少年和成人发病的疾病往往对女性的影响不成比例。多项大规模研究也证明了某些认知和行为特征的性别差异、空间旋转和侵略性。这些观察结果可能反映了由于遗传和环境影响的复杂组合而产生的大脑组织的性别差异。迄今为止，测试人脑组织性别差异的最大研究集中在从体内结构磁共振图像（sMRI）中提取的解剖学测量。虽然这些文献的研究结果存在相当大的异质性，但由于所用方法的可能差异，有几项大规模研究恢复了区域人脑体积的高度可重复的性别差异，超过了总大脑大小的性别差异。这些包括男性较大的边缘和颞区体积，以及女性更大的扣带回和前额叶区域体积。

更深入地了解人脑中性别差异的原因和后果具有挑战性，因为它相对难以接近，无法进行侵入性实验，并且存在潜在的环境混淆。我们对哺乳动物大脑区域体积性别差异的理解的重大进展来自啮齿动物研究。这些文献为思考更难研究的人脑中的体积性别差异提供了重要的背景。历史上，使用经典组织学已经确定了啮齿动物大脑区域体积的高度强大的性别差异。这些差异也已使用sMRI方法恢复，类似于用于研究人脑体积区域性别差异的方法。这些组织学和 sMRI 可解决的啮齿动物脑区域体积的性别差异包括雄性终纹（BNST）、内侧杏仁核（MeA）和内侧视前核（MPON）的更大体积。除了这些典型的性别差异外，sMRI 还发现了区域脑容量的其他几种性别差异，包括男性较大的前扣带皮层、海马体和嗅球体积，以及女性较大的小脑、中脑、尾指、丘脑和皮质体积。用于小鼠全脑组织学的现代工具已经确定，来自sMRI的体积性别差异的焦点也是细胞组成性别差异的显着焦点。此外，它们集中在服务于小鼠性别特异性生殖和社会行为的回路中。第三，除了允许对总体积和细胞组成（使用组织学）的性别差异进行配对描述外，小鼠还可以通过遗传和环境操作对区域性别差异进行机械解剖。例如，四核基因型（FCG）模型，其中性染色体的补体（XX与XY）独立于性腺性别（睾丸与卵巢），使研究人员能够理解性腺性别（睾丸或卵巢的存在独立于染色体补体）与性染色体补体（XX与任一性腺性别的XY小鼠）的不同影响。

上述考虑因素推动了对人类和小鼠大脑之间体积性别差异进行系统比较的迫切需求。这种比较将提供两个关键的产出。首先，它将通过正式测试两种远亲哺乳动物之间性别特异性大脑组织的保守性来推进对大脑进化的理解。其次，任何在人类和小鼠中表现出一致体积性别差异的同源大脑区域都将代表转化研究的高优先级目标-利用小鼠的研究机会来支撑人类大脑中性别差异的原因和后果的研究。

在这里，我们表征了来自人类连接组项目和年轻成年小鼠队列的大型年轻成年人类队列中全球和区域脑容量的性别差异。除了平均差异外，我们还评估了脑容量测量方差的性别差异。我们根据体积变化的方向性和幅度，量化了同源脑区域子集中性别特异性脑容量变化的跨物种对应关系。此外，我们通过评估大脑区域在神经解剖学中性别差异的跨物种相似性是否与其同源基因表达水平的跨物种相似性有关，从而在这些解剖学比较的基础上进行。这些对人类和小鼠之间神经解剖学性别差异的定量比较为未来的研究提供了一个重要的参考框架，这些研究试图使用小鼠作为翻译模型来研究人脑中的性别差异。定义那些在人类和小鼠之间高度保守的具有体积性别差异的大脑区域，揭示了哺乳动物大脑发育中性别差异的进化限制，并突出了未来转化研究的高优先级目标。

2. 结果

2.1 男性的大脑比人类的雌性大，但小鼠的大脑却没有

我们首先使用来自两个物种的健康年轻人的结构MRI数据检查了性别对人类和小鼠总组织体积（TTV）的影响。我们在人类中观察到男性的平均TTV明显高于女性（图1A）。相比之下，我们没有观察到小鼠TTV的统计学显着性别差异（图1B）。除了TTV的性别差异外，我们还测试了不同物种的总灰质和总白质体积的性别差异，以了解一种组织类型是否与驱动体积的性别差异有关。在人类中，考虑到年龄和欧拉数后，男性拥有更大的灰质体积和白质体积。相比之下，在小鼠中，总灰质体积没有性别差异，而雄性在考虑年龄和背景菌株的差异后，白质体积明显更大。

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图1 性别对人类和小鼠总组织体积（TTV）的影响。

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图2 性别对人类和小鼠区域脑容量的影响。

2.2 人类和小鼠都存在区域脑容量的性别差异

在对TTV进行校正并调整多重比较后，我们发现65.8%的人类区域在体积上表现出统计学上的显着性别差异，其中63.8%的女性较大，36.3%的男性较大。在小鼠中，58.6%的区域在体积上表现出统计学上的显着性别差异，其中53.0%的雌性较大，47.0%的雄性较大。在人类中，女性偏向（即女性较大）区域的中位效应量（即标准化 β 系数）为–0.09+/–0.09，标准差（SD）（−8.90e-16至–0.44），而对于男性偏向（即男性较大）区域，中位效应量略大，为 0.15+/–0.19，SD（0.0008至0.84）（图2A）。在小鼠中，雌性偏向区域的中位效应大小为-0.19+/-0.13，SD（-0.003至-0.6），与雄性偏向区域的中位效应大小0.20+/-0.20，SD（0.004至1.04）相似（图2B）。接下来，我们确保在人类中，观察到的性别影响不受双胞胎或兄弟姐妹对的影响。此外，我们重复了没有TTV协变的区域分析，发现由于整体大脑尺寸较大，人类的所有区域体积在男性中都更大。然而，在小鼠中，体积的性别差异模式基本保持不变，这可能是由于两性之间大脑总大小的相似性。

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图3 人类和小鼠区域脑容量变异性的性别差异。

在人类中，我们观察到女性在额叶、扣带回、眼眶、躯体感觉、运动、顶叶、海马旁和楔前皮层以及伏隔核的区域体积在统计学上显着大于男性。男性在视觉、枕端、梨状、脑岛、脾后、内侧前额叶皮层、梭形面部复合体以及小脑、脑干、海马体、杏仁核、BNST和下丘脑的体积在统计学上显着更大（图2C).在小鼠中，雌性的听觉、眼眶、内嗅、前扣带回、躯体感觉、运动、额叶和岛叶皮层以及尾指和小脑的区域体积明显更大。男性的嗅球、海马体、脑下、脑干、杏仁核、BNST 和下丘脑的区域体积明显更大（图2D）。区域体积性别差异的显着跨物种一致性包括女性额叶、扣带回、眼眶、体感、运动和听觉皮层体积较大，男性下丘脑、BNST、杏仁核、海马体、脑下、脑干和小脑体积较大。物种之间显着的对立性别差异包括伏隔核、小脑和额叶皮层（人类偏向雄性，小鼠偏向雌性）（图2）。值得注意的是，有几个区域在小鼠中显示出性别特异性的体积差异，我们在人脑中没有覆盖/分割（由于分辨率或缺乏图谱），因此我们不能得出它们是小鼠特异性的结论。

2.3 人类男性的脑容量差异大于女性，而小鼠的差异没有性别差异

接下来，我们使用Levene的方差相等检验评估了每个物种全球和区域脑容量方差的性别差异。男性的TTV方差明显大于人类的雌性，而小鼠的TTV方差没有性别差异（图3A、3B）。在人类中，经过多次比较，男性的几个区域脑容积（TTV、年龄和欧拉数的残差）显示出男性比女性更大的差异。在小鼠中，在多次比较校正后，没有大脑区域（TTV，年龄和背景菌株的残留）显示出方差的性别差异，然而，在p<0.05的宽松阈值下，小鼠在小脑某些区域的区域体积差异中显示出性别差异，包括小脑，舌核和紧固核，以及嗅球和视觉，感觉运动皮层和CA1（女性>男性）（图3）。在重复分析区域体积方差后，这些发现保持不变，而没有对TTV进行残差。

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图4 性别效应对人脑和小鼠大脑同源区域体积的相关性。

2.4 同源大脑区域大小的性别差异在物种之间是相似的

接下来，我们专注于一组预定义的同源大脑区域，这些区域具有良好同源性，实现脑容量区域性别差异的正式定量跨物种比较。在r=0.30（p=0.013）时，所有同源大脑区域的性别效应大小的稳健相关性较强（图4A），皮层（r = 0.33，p = 0.10）的相关性和非皮层（r=0.16，p=0.35）都没有显着相关性（图4B）。

两个物种的雌性（q<0.05）的同源大脑区域在统计学上显着更大，包括双侧初级躯体感觉皮层，初级听觉皮层和前扣带皮层。两个物种的雌性右后顶叶关联区较大，但仅在人类中显著（q<0.05），而双侧初级运动区和左丘脑在两个物种的雌性中都较大，但在小鼠中仅显着（q<0.05）。最后，雌性的左丘脑和左腹侧眼眶面积较大，但在两个物种中都不显着。在两个物种的雄性中，统计学上显着较大的同源区域（q<0.05）包括双侧杏仁核，双侧苍白球，海马体，BNST，下丘脑和脑干。此外，两个物种的雄性左侧原发视觉区、右侧脾后区和脑桥均较大，但仅在人类中显著，而CA3在两者中均偏向雄性，但仅在小鼠中显著。物种间体积性别差异方向不一致的区域是双侧颗粒岛叶和小脑皮层（小鼠偏向雌性，但人类偏向雄性）（图5）。

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图5 同源大脑区域在物种之间显示出一致或不同的性别偏见。

正如预期的那样，鉴于人类而非小鼠的TTV具有强大的性别差异，我们在不控制TTV的情况下重复上述分析时，观察到同源大脑区域体积的性别差异的较弱的稳健相关性。在皮层区域，r=−0.04（p=0.86）的相关性较低，而对于非皮层，相关性略强，但为负，r=−0.20（p=0.25）。在人类中，由于男性的整体大脑尺寸较大，男性的同源区域子集都较大。在小鼠中，我们观察到的性别偏倚模式与我们在针对TTV的分析中观察到的相同模式，除了右伏隔核显示没有性别偏倚和脑桥中的男性偏倚。

2.5 物种之间体积性别差异更一致的区域往往在基因表达特征上更一致

接下来，我们探讨了物种之间体积性别差异更相似的区域是否在基因表达谱上也更相似。为了得出解剖学性别差异物种间一致性的区域级测量（以下简称“解剖学性别效应相似性评分”），我们将60个同源大脑区域中每个区域的人类和小鼠性别效应大小相乘。为了得出跨物种转录相似性的区域水平测量，我们利用了来自Allen Human和Allen Mouse Brain Atlases的基因表达数据，在上面定义的同源区域的子集中。我们将基因集过滤为仅人鼠同源基因，并关联同源基因的区域表达，以得出每个大脑区域跨物种转录相似性的度量。这些分析考虑了56个同源脑区域和2835个同源基因。上述步骤对56个同源大脑区域中的每一个区域产生了两个测量值：解剖学性别效应相似性评分和转录相似性评分。

转录相似性得分在0.003和0.43之间，平均/中位相关性为0.30（图6）。在同源大脑区域中，这种转录相似性的区域间变异与解剖学性别效应相似性呈正相关（图6A）。脑区室分层显示，皮质区域的这种关系比非皮质区域更强，且具有统计学意义（图6B）。可视化这些关系表明，表现出较高解剖学性别效应相似性分数的皮质区域（主要是初级感觉皮层）往往表现出高于平均水平的转录相似性（即r>0.3），而解剖学性别效应相似性分数较低的皮质区域（主要是边缘皮层）表现出低于平均水平的转录相似性。皮层下区域未能显示解剖学性别效应相似性和转录相似性之间的对应关系。然而，在将BNST排除在分析之外后，解剖学性别效应相似性与转录相似性之间的相关性仍然很低。

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图6 解剖学性别一致性和基因表达在同源大脑区域之间显示出适度的相关性。

最后，通过使用生物学上知情的同源基因子集重新计算相关性，是否会显着改变观察到的解剖学性别效应相似性和转录相似性之间的相关性。在这些敏感性分析中，我们观察到使用X连锁基因与皮质和非皮质区域具有更强相关性的完整基因集具有相似的相关性。有趣的是，我们观察到这种模式的例外，即参与雄激素与雌激素和孕激素途径的性激素基因子集。基于雄激素通路的转录相似性评分与皮层解剖学性别效应相似性评分呈弱相关（r=0.05，p=0.81），但与非皮质区域的解剖学性别效应相似性强相关（r=0.46，p=0.01）。相比之下，基于雌激素/孕激素通路的解剖学性别效应相似性与转录相似性之间的相关性在皮层中为正（r=0.29，p=0.15），但在非皮层中为负（r=-0.27，p=0.15）。最后，我们通过随机重采样同源基因的各种亚群10000次来重新计算转录相似性，然后将这些相似性值与跨区域的解剖学性别一致性相关联。

3. 讨论

这项研究首次跨物种比较了性别对人类和小鼠大脑解剖学的影响。我们的研究结果表明，整体脑容量的性别差异在物种之间并不保守，但区域体积的性别差异存在有意义的跨物种一致性。此外，物种之间具有更相似的性别效应的区域也倾向于表现出更相似的转录谱，特别是在皮质大脑区域之间。这项工作对理解哺乳动物大脑中的性别差异，使用小鼠作为人类性别差异的翻译模型以及人类和小鼠之间比较结构神经成像的更广泛主题具有重要意义。

首先，与之前的许多观察结果一致，我们发现在人类中，男性的平均脑容量比女性大。相比之下，我们观察到小鼠大脑总大小没有性别差异，这与最近的一项研究一致，该研究报告称脑总体积、细胞密度和总细胞数量没有性别差异。在之前的研究中，C57BL6 / J小鼠仅报告了大脑总大小的细微性别差异。然而，当考虑到体重的性别差异时，大脑大小的这种细微差异会消失，而在人类中则不是这样，在考虑体型时，大脑大小的性别差异会受到抑制，但不会消失。

正如脑总体积的性别差异所见，人类和小鼠在解剖学差异的性别差异方面也表现出惊人的对比。在人类中，男性在总脑容量和区域脑容量测量方面都表现出更大的差异，这与之前的发现一致。在小鼠中，没有观察到解剖学差异的性别差异。虽然以前没有在小鼠中研究过大脑解剖结构的差异，但已经观察到形态特征的雄性变异性更大，而免疫学和代谢性状的雌性变异性更大。在人类而不是小鼠雄性中观察到更大的神经解剖学差异，质疑雄性更具变异性的理论，因为它们是异配子（具有XY染色体），因为雄性小鼠也是异配子。了解大脑结构变异性性别差异的原因可能为理解男性特异性大脑发育或神经发育障碍提供线索。

在考虑了全球大脑大小差异后，我们确定了人类和小鼠大脑中区域体积的几个性别特异性差异，其中一些显示出物种间一致的性别差异。对于这些区域，小鼠中可用的机制信息可用于完善人类的机制假设。我们发现，这两个物种的雄性都具有更大的杏仁核、海马体、BNST 和下丘脑体积。啮齿动物研究表明，sMRI定义的体积差异的出现与BNST和MPON细胞凋亡性别差异的发育时间一致，以及MeA突触组织中的性别差异，这些偏向男性的区域也往往比偏向女性的大脑区域显示出更大的密度。为了进一步支持激素的组织作用，男性化的雌性小鼠在BNST和MeA以及行为方面表现出雄性典型的性别差异。FCG小鼠的神经影像学研究确定了性染色体剂量的性激素对大脑解剖结构的独立影响。例如，具有睾丸的小鼠的MeA比具有卵巢的小鼠大，但在XY中比XX小鼠小，这进一步指出了性激素在塑造这一特定大脑区域中的重要性。虽然我们没有人类的因果机制数据，但神经影像学研究表明，在早期发育中会出现男性偏向的区域体积差异，并且可能对胎儿睾丸激素暴露量敏感。在雌性中，我们发现这两个物种都具有与人类一致的更大的前扣带回、体感和初级听觉皮层和小鼠研究。虽然驱动区域脑容量中女性偏向的机制尚不清楚，但两个物种的神经影像学研究发现，女性特异性脑容量增大往往在青春期出现，这可能指出青春期激素在塑造大脑结构中的重要作用。在物种之间表现出一致性别差异的区域，例如初级躯体感觉皮层，可能是在小鼠大脑中进行与人类相关的机制研究的高优先级目标。

我们还观察到一个物种在体积上存在显着性别差异的区域，而在另一个物种中不存在或倒置，包括颗粒岛和小脑皮层（人类偏向雄性，小鼠偏向雌性）。这种不一致可能是由于这些区域组成的物种差异。例如，最近一项比较人类、猕猴和小鼠小脑的研究确定了一组祖细胞存在于人脑中，但不存在于小鼠或猕猴中。此外，对人类和小鼠颞中回细胞群的比较发现，在人类中，神经元和非神经元细胞之间存在更大的相互作用，以及神经胶质细胞的多样性和密度更大，这反过来可能导致大脑大小的跨物种差异。性别效应的差异可能是由于基因表达模式的差异。这一想法得到了我们的分析的支持，这些分析结合了大量区域基因表达的信息，该信息在很大程度上受细胞组成的影响。物种之间具有更相似基因表达谱的大脑区域也倾向于在物种之间表现出更相似的体积性别差异。最后，跨物种性别效应的缺乏一致性也可能是由于大脑区域功能的物种差异。

我们基于解剖学性别差异和同源基因表达的相似性对同源大脑区域进行了比较，揭示了这些指标之间良好的跨物种一致性。这种关系在皮质区域比在非皮质区域强得多。在皮质区域内，初级感觉区域表现出更强的转录和解剖学性别一致性，而边缘结构表现出较低的一致性。在非皮质区域，转录相似性在各区域之间是一致的，与解剖学性别一致性无关。限制X连锁基因的同源基因集并没有改变解剖学效应和转录相似性之间的一致性，然而，限制基因包括性激素基因确实如此。基于雄激素基因的转录相似性与皮质性别效应呈弱相关，但与非皮质性别差异呈强相关，而基于雌激素和孕激素基因的转录相似性与皮质呈正相关，但与非皮质性别效应呈负相关。这一有趣的观察结果可能表明性激素在大脑皮质或非皮质性别差异模式中的不同作用，这值得进一步研究。

这里提出的研究结果表明，区域性别差异存在适度的跨物种一致性，但人类和小鼠表现出性别对整体大脑大小的影响非常不同。我们对驱动人类整体大脑大小性别差异的机制的有限因果理解对这种跨物种差异的解释提出了挑战。从理论上讲，体型性别差异（以及这对大脑大小的贡献）的潜在进化驱动因素是在配偶竞争较高的物种中对较大体型的性选择。然而，性别对总脑容量影响的物种间差异的进化原因很难通过经验进行检验。相比之下，有经验证据表明性激素和性染色体在塑造大脑大小的性别差异中的作用，因此，这些生物过程调节中的物种差异可能导致大脑大小的物种差异。对人类的大规模神经影像学研究表明，在幼儿期出生时，甚至产前。因此，这些差异可能反映了人脑中循环性类固醇和/或性染色体剂量的性别差异对产前和围产期的影响，其中男性暴露于围产期睾丸激素激增，而女性则没有。虽然在产前和产后早期，小鼠大脑总大小的性别差异尚未得到很好的表征，但有一些体外实验证据表明，性腺类固醇对人类与小鼠早期神经发生的差异作用。在人脑类器官中，体外雄激素暴露与兴奋性皮质祖细胞和放射状神经胶质细胞的增殖增加有关，增加了神经源性生态位。相比之下，在小鼠脑类器官中，雌二醇而不是睾酮暴露导致祖细胞增殖增加。这种物种差异与性腺类固醇通过芳香化睾酮激活雌激素 E2 受体使小鼠大脑男性化的证据一致，而性腺类固醇对灵长类动物大脑的男性化作用更依赖于睾酮对雄激素受体的直接激活。还有一些证据表明，性染色体剂量可能与人类与小鼠的大脑大小存在差异关系。在性染色体非整倍体的人类中，Y 染色体剂量的增加与大脑总大小的增加有关，而 X 染色体剂量的增加与大脑总大小的减少有关。重要的是，这些全球差异并没有在小鼠大脑中得到概括，其中额外的 X 染色体或 Y 染色体剂量与大脑大小的任何差异无关。

这里介绍的工作应该根据一些警告和局限性来考虑。首先，虽然我们使用详细的分割来表征人类和小鼠大脑中的性别差异，但小鼠中的几个典型的性别偏向细胞核很难用人类MRI检测到。其次，与我们之前的研究一样，我们采用了一种基于包裹的方法，该方法仅限于解剖学上定义的大脑结构，其中跨物种的一对一映射可能并不总是准确的。第三，我们专注于青年时期大脑解剖学的比较，但跨越不同的空间和时间尺度对于我们理解跨物种性别差异的出现和进化至关重要。第四，我们对基因表达数据的整合依赖于可用的图谱，这些图谱主要（人类）或完全（小鼠）来自男性大脑。第五，虽然人类和小鼠的比较为哺乳动物性别偏向大脑发育的比较分析提供了重要的第一步，但正式的系统发育分析将需要纳入其他动物的数据，包括非人类灵长类动物。最后，尽管我们仔细描述了大脑解剖学中的性别差异，但重要的是要强调，这种差异不提供有关大脑功能或行为的信息。此外，人类大脑发育中的性别差异很可能是由密切相关但不同的性别结构独特地塑造的，这种性别通常被认为在包括小鼠在内的所有非人类动物中都不存在。

尽管存在这些限制和警告，但我们表明，全球大脑大小的性别差异在物种之间并不保守，但区域脑容量的性别差异确实显示出人类和小鼠之间的一些一致性。此外，我们发现，与非皮质结构相比，同源大脑区域子集的体积性别差异的人与小鼠的一致性更强，并且 - 特别是在皮层中 - 与区域基因表达的跨物种相似性相呼应。总之，这种对人类和小鼠性别偏见的神经解剖学的定量比较可能会为未来的转化研究提供信息，这些研究旨在使用小鼠来更好地了解人脑中的性别差异。

4. 材料和方法

4.1 人类参与者和神经影像学数据

数据采集：人类样本包括 3T T1 加权 0.7 mm3来自人类连接组项目（HCP）的 sMRI。募集程序和扫描采集参数（T1-MPRAGE：TR=2400 ms;TE=2.14 毫秒;TI=1000 毫秒;翻转角度=8度;FoV=224 × 224 mm）。所有个人都提供了参与研究的知情同意。HCP数据（部分）由华盛顿大学-明尼苏达大学人类连接组项目联盟提供。

皮质形态测量：T1加权sMRI数据使用PreFreesurfer进行预处理。接下来，我们使用 Freesurfer（版本 7.1.0）的 recon-all 和高分辨率标志以数据的原始分辨率重建和打包所有个体的皮层。mri_anatomical_stats实用程序用于从皮质表面提取包括皮质体积在内的几个特征。这些顶点级测量值是从多模态信息的 Glasser 人类连接组项目图谱的360个区域中取平均值的。

皮质下形态测量：对于皮层下分割，使用Freesurfer特征。在40个标签中，有20个被纳入分析，因为它们对灰质结构进行了分割。我们的目标是在上述标准细分的基础上，包括更多以前被证明是性别偏见的细胞核。我们使用了FreeSurfer对海马亚场和脑干的联合分割。由于下丘脑和包括 BNST 在内的相关细胞核无法通过 FreeSurfer 获得，因此我们使用了不同的已发表图谱。通过将图谱标签注册到我们研究的特定平均值（使用基于变形的形态测量处理和基于 ANT 的工具 Devenyi来进行分割。在下丘脑图谱的感兴趣区域内求和体素体积差异以生成结构体积。最后，每个分割（皮质和皮质下）都进行视觉质量控制，以确保区域边界与解剖结构相匹配，如果存在分割错误，则排除在外。

4.2 小鼠受试者和神经影像学数据

数据采集：本研究中包括的小鼠都是来自大量自闭症小鼠模型的野生型对照，这些模型由来自不同实验室的不同队列组成，被送到多伦多的小鼠成像中心进行神经成像。为了模拟年轻成年小鼠大脑中的规范性别差异，我们纳入了来自实验室队列的野生型小鼠，这些小鼠在C57BL6（J或N）背景菌株上至少有5只雄性和5只雌性。我们统一了背景菌株中队列之间的神经影像学测量。这种方法是一种流行的调整方法，最初是为基因组学数据开发的，但适用于神经影像学协调，以协调扫描仪的测量。

数据处理：使用基于无偏变形的形态测量配准管道配准 sMRI 进行配准。这导致了一个平均的大脑，从中可以计算出对数变换的雅可比行列式，这些编码了每个小鼠大脑和普通大脑之间的体素体积差异。sMRI 还使用先前发表的图集被分割成355个独特的大脑区域使用 MAGeT 大脑算法。进行视觉质量控制以评估配准和分割的准确性。

4.3 基因表达数据

人类基因表达数据：人类基因表达数据是从艾伦人脑图谱中获得的，从艾伦研究所的API下载，并使用Python中的abagen包进行预处理。正如 Beauchamp 等人，来自所有六个供体的数据都进行了预处理，产生了一个包含所有供体的15627个基因和3702个样本的逐个样本表达矩阵。

小鼠基因表达数据：小鼠基因表达数据来自Allen Mouse Brain Atlas。简而言之，使用艾伦研究所的 API，冠状动脉原位杂交实验下载全脑原位杂交表达数据，并以医学图像NetCDF格式重塑为3D图像，并按照 Beauchamp 等人之前的描述进行预处理。该预处理管道的结果是具有3958个基因和61315个体素的逐个体素表达矩阵。

4.4 同源区域内同源基因的表达基质

为了获得上述每个同源脑区域的基因表达数据，将用于执行分割的人类图谱注册到MNI ICBM 152 2009 c非线性对称空间中，每个人类样本都用60个脑区域标签之一进行注释。有几个区域缺少来自人类右半球的表达数据，包括右下丘脑、BNST、DG 和 CA3，因此我们将左半球数据反射到右半球，以增加后续分析的样本。此外，MeA和MPON缺少转录组数据，因此被排除在这些分析之外，总共产生了56个同源脑区。同样，小鼠图谱被注册到艾伦小鼠大脑公共坐标框架（CCFv3）空间中，每个体素都用56个大脑区域标签之一进行注释。接下来，我们为人类和小鼠创建了一个按区域基因表达的基质。对于人类，我们根据感兴趣区域的体积对基因表达数据的平均值进行加权;这一点尤为重要，因为我们结合了人类图谱中的几个区域来获得我们的同源区域。对于小鼠，我们平均了感兴趣区域内的体素水平基因表达数据。为了获得同源基因，将每个物种的完整基因集与从 NCBI HomoloGene 数据库获得的3331个同源基因列表相交，产生2835个同源基因存在于两个物种的表达基质中。每个基质在大脑区域进行 z 评分，以标准化基因表达测量。

4.5 统计分析

4.5.1 全局和区域平均脑容量的性别差异

人：所有统计分析均在 R 版本 3.4.2 中执行。使用线性模型来检验性别的影响。错误发现率（FDR）校正应用于对照组，将预期的假阳性比例q设置为0.05。

鼠：通过使用线性模型在小鼠中复制在小鼠中进行的分析，以测试性别的影响（β1：男性与女性）的 Z 评分全局或区域脑容量。平均年龄 （β2）、TTV（β3）和背景菌株（β4）也作为协变量（Ɛ：误差项）包括在内。同样，性别的 beta 值 （β1）称为标准化效应量。

4.5.2 跨物种比较

性别偏见的大脑解剖学：为了测试人类和小鼠的性别效应之间的收敛性，我们考虑了 60 个大脑区域的子集，这些区域基于比较结构和功能研究具有公认的同源性。我们利用以前的工作，使用六个细胞结构和 MRI 衍生的人类图谱绘制人类和小鼠之间的大脑区域，以及三个细胞结构小鼠图谱（以及两个大鼠图谱），以缩小具有跨物种同源物的区域。我们计算了性别对每个区域体积的标准化效应大小，如上一节所述，适用于人类和小鼠。我们使用强大的相关性来确定跨物种间区域脑容量的性别差异的相似性，方法是将不同区域物种之间的性别效应大小相关联。我们还使用在每个物种中得出的效应量估计值重复了这一分析，而没有对TTV进行协变量。

检验性别差异的跨物种一致性是否与基因表达的跨物种相似性有关：为了得出体积性别差异的跨物种一致性的区域测量，我们将每个物种的性别效应大小相乘。接下来，为了得出跨物种转录相似性的区域测量，我们计算了人类和小鼠每个大脑区域所有同源基因的缩放表达值之间的 Pearson 相关性。具体来说，我们比较了皮质与皮质下区域保守性效应和保守表达之间的相关性，并使用以下同源基因子集重新计算了这些相关性。性激素信号转导基因是根据Bader实验室的生物过程模块的基因本体数据鉴定的。对于使用基因子集的每次分析，我们根据10000个随机抽样的相同大小的基因集生成相关性的零分布，并使用 R 推断包中的“get_p_value”函数将观察到的相关性与这些零分布进行比较。

参考文献：Comparative neuroimaging of sex differences in human and mouse brain anatomy.