GEO

library(GEOquery)

gse_number = "GSE56649"
eSet <- getGEO(gse_number, destdir = '.', getGPL = F)#getGEO有从GEO中下载数据到工作目录下，并将数据读取到R中。

library(AnnoProbe)
gse_number = "GSE56649"
eSet=geoChina(gse_number)

 class(eSet)#列表
 length(eSet)#列表的长度
 eSet = eSet[[1]]
 exp <- exprs(eSet)#(1)提取表达矩阵exp
 dim(exp)#矩阵几行几列
 exp[1:4,1:4]#看数据是否正常，看数据是否取过log,如果取过log，则数据在0~20中间差不多。还可以画箱线图看是否正常，正确情况下每个样本的整体都差不多。

exp = log2(exp+1)#之所以要+1是因为害怕exp有数据=0，这样log2(0)就是负无穷了。
boxplot(exp)

 pd <- pData(eSet)

p = identical(rownames(pd),colnames(exp));p#判断两个数据的行名和列名是否一致
if(!p) exp = exp[,match(rownames(pd),colnames(exp))]#如果不一致，进行该行操作。

gpl_number <- eSet@annotation;gpl_number#提取的符号有@和$，该用哪个，我们可以一一试一试。
save(gse_number,pd,exp,gpl_number,file = "step1output.Rdata")#保存编号，ges_number是保存总的样本集编号，pd是临床信息，exp是表达矩阵、gpl_number是芯片平台编号

load(file = "step1output.Rdata")
library(stringr)

 if(F){
  # 1.Group----
  # 第一种方法，有现成的可以用来分组的列
  Group = pd$`disease state:ch1` #这个`是在我们提取的一列名称中有空格时，R语言会自动生成`
}else if(F){
  # 第二种方法，自己生成   有风险，可能会数错数！
  Group = c(rep("RA",times=13),
            rep("control",times=9))
  Group = rep(c("RA","control"),times = c(13,9))
}else if(T){
  # 第三种方法，使用字符串处理的函数获取分组   比较万能，只要两个分组中可以有一个明确的字符串来检测就可以
  Group=ifelse(str_detect(pd$title,"control"),#str_detece是检查是否有这个字符串的意思，如果有是T，如果没有是F
               "control",#ifelse是如果括号中的检测结果是T，则用control替换T，否则用RA替换F
               "RA")
}

 

Group = factor(Group,levels = c("control","RA"))# 如果不加level，那么将按因子名字的首字母排序
Group

library(tinyarray)
find_anno(gpl_number) # 打出找注释的代码，根据gpl_number来找探针序号所对应的真正的探针基因序列
ids <- AnnoProbe::idmap('GPL570')

if(!require(hgu133plus2.db))BiocManager::install("hgu133plus2.db")
library(hgu133plus2.db)
ls("package:hgu133plus2.db") # 查看该包里面有什么
ids <- toTable(hgu133plus2SYMBOL)# symbol代表的是探针的ID和基因symbol，toTable是提取
head(ids)

if(F){
  b = read.delim("GPL570-55999.txt",
               check.names = F,
               comment.char = "#")# read.delim是读取该文件
  colnames(b)
  ids2 = b[,c("ID","Gene Symbol")]#提取列
  colnames(ids2) = c("probe_id","symbol")#修改列名
  k1 = ids2$symbol!="";table(k1)#去掉表格中的有空格的那一行，说明该探针没有对应的基因
  k2 = !str_detect(ids2$symbol,"///");table(k2)# 去掉表格中一个基因对应多个探针的那一行，///代表把两个基因分隔开
  ids2 = ids2[ k1 & k2,]
}

save(exp,Group,ids,gse_number,file = "step2output.Rdata")

dat=as.data.frame(t(exp))#转置，将数据框的横纵左边转置变成矩阵，之后再as.data.frame转成数据框
library(FactoMineR)
library(factoextra) 
dat.pca <- PCA(dat, graph = FALSE)
pca_plot <- fviz_pca_ind(dat.pca,
                         geom.ind = "point", # show points only (nbut not "text")
                         col.ind = Group, # color by groups
                         palette = c("#00AFBB", "#E7B800"),
                         addEllipses = TRUE, # Concentration ellipses
                         legend.title = "Groups"
)
pca_plot
save(pca_plot,file = "pca_plot.Rdata")

cg=names(tail(sort(apply(exp,1,sd)),1000))# 把标准差最大的1000个基因挑选出来，标准差大不一定是差异基因，只能代表其是活跃基因
n=exp[cg,]

library(pheatmap)
annotation_col=data.frame(group=Group)#增加热图上的分组条
rownames(annotation_col)=colnames(n) 
 pheatmap(n,
         show_colnames =F,
         show_rownames = F,
         annotation_col=annotation_col
         cluster_cols=F# 意思是不进行聚类，热图的顺序就是分组的顺序
)#这样得到的热图是表达矩阵里的所有数据都进行作图

pheatmap(n,
         show_colnames =F,
         show_rownames = F,
         annotation_col=annotation_col,
         scale = "row",
         breaks = seq(-3,3,length.out = 100)#设置色带分布范围，从-3到3，等差数列增加，形成100个色带值
         )                                #一般设置色带分布范围不能太大，这样太离群的数据会被突出显示，而正常数据差异区分的不明显。
dev.off()

library(limma)
design=model.matrix(~Group)
fit=lmFit(exp,design)
fit=eBayes(fit)
deg=topTable(fit,coef=2,number = Inf)
#这几行代码是做差异分析的，不需要改的，直接用

library(dplyr)
deg <- mutate(deg,probe_id=rownames(deg))

ids = ids[!duplicated(ids$symbol),]# 或者用这种随机去重方式ids = diatinct(ids,symbol,.keep_all=T)
#其他去重方式在zz.去重方式.R
deg <- inner_join(deg,ids,by="probe_id")
nrow(deg)

logFC_t=1
p_t = 0.05 #设置logFC和p-value的阈值，把阈值调大一些，差异基因的数量就会相对增加一些
k1 = (deg$adj.P.Val < p_t)&(deg$logFC < -logFC_t)#这里用agj.p.value做纵坐标
k2 = (deg$adj.P.Val < p_t)&(deg$logFC > logFC_t)#k1是下调基因的条件，k2是上调基因的条件
deg <- mutate(deg,change = ifelse(k1,"down",ifelse(k2,"up","stable")))
table(deg$change)

library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
s2e <- bitr(deg$symbol, 
            fromType = "SYMBOL",
            toType = "ENTREZID",
            OrgDb = org.Hs.eg.db)#人类
deg <- inner_join(deg,s2e,by=c("symbol"="SYMBOL"))#将增加的那一列添加到表达数据框中，by=c(a,b)是Merge的两个数据框中列名的大小写不一样，这个操作是统一大小写
save(Group,deg,logFC_t,p_t,gse_number,file = "step4output.Rdata")

library(dplyr)
library(ggplot2)
p <- ggplot(data = dat, 
            aes(x = logFC, 
                y = -log10(adj.P.Val))) +
  geom_point(alpha=0.4, size=3.5, 
             aes(color=change)) +
  scale_color_manual(values=c("blue", "grey","red"))+
  geom_vline(xintercept=c(-logFC_t,logFC_t),lty=4,col="black",linewidth=0.8) +
  geom_hline(yintercept = -log10(p_t),lty=4,col="black",linewidth=0.8) +
  theme_bw()
p

dat  = deg[!duplicated(deg$symbol),]#去重复


for_label <- dat%>% 
  filter(symbol %in% c("HADHA","LRRFIP1"))#选择标记到图上的基因

volcano_plot <- p +
  geom_point(size = 3, shape = 1, data = for_label) +
  ggrepel::geom_label_repel(
    aes(label = symbol),
    data = for_label,
    color="black"
  )
volcano_plot

load(file = 'step2output.Rdata')
# 表达矩阵行名替换
exp = exp[dat$probe_id,]
rownames(exp) = dat$symbol#把探针的id换成基因的名字
if(T){
  #取前10上调和前10下调
  library(dplyr)
  dat2 = dat %>%
    filter(change!="stable") %>% 
    arrange(logFC) 
  cg = c(head(dat2$symbol,10),#前10个
         tail(dat2$symbol,10))#后10个
}else{
  # 全部差异基因
  cg = dat$symbol[dat$change !="stable"]
  length(cg)
}
n=exp[cg,]
dim(n)

# 差异基因热图
library(pheatmap)
annotation_col=data.frame(group=Group)
rownames(annotation_col)=colnames(n) 
heatmap_plot <- pheatmap(n,show_colnames =F,
                         scale = "row",
                         #show_rownames=F,这行代码是运行全部差异基因时，去掉热图上基因的名字，要不然都叠到一起了
                         #cluster_cols = F, 这行代码是把聚类和分组对应
                         annotation_col=annotation_col,
                         breaks = seq(-3,3,length.out = 100)
) 
heatmap_plot

library(patchwork)
volcano_plot +heatmap_plot$gtable#热图和火山图拼到一起

library(corrplot)
g = sample(deg$symbol[1:500],10) # 这里是随机取样，注意换成自己感兴趣的基因，从前500行中随机取10个
g

M = cor(t(exp[g,])) # t(exp[g,])是转置，行变成列，然后cor()计算列与列之间的相关性
pheatmap(M)

library(paletteer)#配色R包
my_color = rev(paletteer_d("RColorBrewer::RdYlBu")) # paletteer_d（）是包里的颜色，rev()就逆转了包里颜色的顺序
my_color = colorRampPalette(my_color)(10) #把这一组颜色切分成10中颜色
corrplot(M, type="upper", #画的cowplot是不能赋值的
         method="pie",
         order="hclust", 
         col=my_color,
         tl.col="black", 
         tl.srt=45)
library(cowplot) 
cor_plot <- recordPlot() #只有当画图框里有图才能被记录

load("pca_plot.Rdata")
plot_grid(pca_plot,cor_plot,
          volcano_plot,heatmap_plot$gtable)
dev.off()

pdf("deg.pdf")
plot_grid(pca_plot,cor_plot,
          volcano_plot,heatmap_plot$gtable)
dev.off()

load(file = 'step4output.Rdata')
library(clusterProfiler)
library(ggthemes)
library(org.Hs.eg.db)
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(stringr)
library(enrichplot)

gene_up = deg$ENTREZID[deg$change == 'up'] 
gene_down = deg$ENTREZID[deg$change == 'down'] 
gene_diff = c(gene_up,gene_down)#合并上调基因和下调基因

f = paste0(gse_number,"_GO.Rdata");f
if(!file.exists(f)){
  ego <- enrichGO(gene = gene_diff,
                  OrgDb= org.Hs.eg.db,#物种来源
                  ont = "ALL",
                  readable = TRUE)#entrezid又变成sample，具有可读性
  ego_BP <- enrichGO(gene = gene_diff,
                  OrgDb= org.Hs.eg.db,
                  ont = "BP",
                  readable = TRUE)
  #ont参数：One of "BP", "MF", and "CC" subontologies, or "ALL" for all three.
  save(ego,ego_BP,file = f)
}
load(f)

barplot(ego)
barplot(ego, split = "ONTOLOGY", font.size = 10, 
        showCategory = 5) + 
  facet_grid(ONTOLOGY ~ ., space = "free_y",scales = "free_y") 

dotplot(ego)

dotplot(ego, split = "ONTOLOGY", font.size = 10, 
        showCategory = 5) + 
  facet_grid(ONTOLOGY ~ ., space = "free_y",scales = "free_y") 

#gl 用于设置下图的颜色
gl = deg$logFC
names(gl)=deg$ENTREZID
#Gene-Concept Network,要放大看
cnetplot(ego,
         #layout = "star",
         color.params = list(foldChange = gl),
         showCategory = 3)

gene_up = deg[deg$change == 'up','ENTREZID'] 
gene_down = deg[deg$change == 'down','ENTREZID'] 
gene_diff = c(gene_up,gene_down)

f2 = paste0(gse_number,"_KEGG.Rdata")
if(!file.exists(f2)){
  kk.up <- enrichKEGG(gene         = gene_up,
                      organism     = 'hsa')
  kk.down <- enrichKEGG(gene         =  gene_down,
                        organism     = 'hsa')
  kk.diff <- enrichKEGG(gene         = gene_diff,
                        organism     = 'hsa')
  save(kk.diff,kk.down,kk.up,file = f2)
}
load(f2)

table(kk.diff@result$p.adjust<0.05)
table(kk.up@result$p.adjust<0.05)
table(kk.down@result$p.adjust<0.05)
#实验数据在KEGG中没有富集到很正常，因为KEGG的数据库本来就很小。

source("kegg_plot_function.R")#在不打开该文件的前提下全选运行
g_kegg <- kegg_plot(kk.up,kk.down)
g_kegg