临床样本组学研究Day8:多组学研究模式（一）：蛋白质+代谢组学联合分析

基于多组学联合的研究已经成为诸多CNS及子刊等高分文章的设计思路，“蛋白+代谢”联合作为“打通机制与表型的研究”，能够系统描绘蛋白至代谢的调控过程，挖掘关键蛋白与代谢物上下游调控通路，已应用于疾病机制、标志物发现、药物研发、植物生理等诸多领域。

今日解密

蛋白+代谢联合分析原理

蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组学( Proteomics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质组是细胞功能和状态的直接描述。

代谢物是生物体中的基础活动物质，通过代谢组分析，获得一个生物体中所有内源性小分子代谢产物的集合。小分子的产生和代谢是一系列调节事件的最终结果，蛋白质组学引起的功能改变会在代谢层面放大。

蛋白质组和代谢组的关联分析，主要分为以下两个方面：

1.基于通路层面的联合分析：

通过KEGG 代谢通路将蛋白质组和代谢组数据联合起来，找到同一生物进程（KEGG Pathway）中发生显著性变化的蛋白质和代谢物，快速锁定关键蛋白和代谢物。再结合富集分析、KEGG通路标色等实现关联结果的可视化。

2.基于表达层面的联合分析：

通过差异表达蛋白和代谢物的表达量数据进行联合分析，找出具有同步变化规律的差异蛋白和代谢物，在结合相关系数矩阵热图、相关性分析聚类热图、相关系数调控网络图进行个性化的分析。

案例分享

一篇基于蛋白质组学的人类缺血性心肌病 (ICM)和扩张性心肌病 (DCM) 的功能核心蛋白元件和性别相关性富集通路研究，于2020年发表在Nature子刊。

Nat Commun. 2020 Jun 2;11(1):2843.

试验目的

1. 明确不同心肌病（缺血性心肌病和扩张性心肌病）病因的心脏组织蛋白质组和代谢组学特征；
2. 了解不同性别的心肌病患者病态心肌蛋白质组学特征的差异，为疾病的性别差异化治疗、预后评估，以及性别相关激素对心衰发生发展的影响的生物机制研究提供线索

试验方法

1. For discovery：混合所有心肌样本的消化（包括DCM、ICM和control case）基于DDA技术（数据依赖性采集）建立心肌蛋白质和肽分子文库—一构建蛋白参考文库（6182个心肌样本蛋白质）
2. For quantification：基于DIA技术（数据非依赖性采集）的蛋白质组学定量技术分析DCM &ICM样本和control样本之间的差异蛋白质——识别每个样本的肽和蛋白（3264个蛋白质，其中2614个蛋白质在75%的样本中存在）

试验流程

图1.试验流程图

a.概述病理学、样本采集、应用的组学平台和分析的示意图;b所有测量患者和捐赠者的年龄分布。c 供体心脏、缺血性心脏病和扩张型心肌病组的性别计数。

主要试验结果

01

蛋白质组学

作者首先进行ICM和DCM与供体之间的PCA分类和蛋白质表达水平的差异分析：

• 将蛋白质组数据进行降维（PCA），包括所有三种情况（ICM、DCM、供体）和两种性别；
• 总共有 185 和 377 种蛋白质分别在 ICM 与供体和 DCM 与供体心脏之间差异表达（DE），核心蛋白质组由 ICM 和 DCM 中调节的 153 种蛋白质组成，而 ICM 或 DCM 中分别有 32 种和 224 种蛋白质。

图 2：ICM 或 DCM 与供体之间蛋白质表达水平的差异分析。

02

代谢组学

作者继续用 PCA 评估代谢组数据，显示在全球代谢组学水平上供体心脏与 ICM 和 DCM 心脏的明显分离。作者接下来确定了 ICM 与供体、DCM 与供体之间调节的代谢物，并揭示两种心肌病共有的一组核心调节代谢物。

图 3：ICM 或 DCM 与供体之间代谢物丰度水平的差异分析。

03

蛋白质-代谢物通路分析

在 ICM 和 DCM 的蛋白质和代谢物水平上进行通路分析，并通过 KEGG进行注释。

显示了 ICM 和 DCM 在蛋白质和代谢物水平上调节的共同途径。在这两种疾病中，甲状腺激素合成、碳水化合物消化和吸收、雌激素信号通路、“代谢物通路”和醛固酮调节的钠重吸收通路在蛋白质和代谢物水平上都受到调节，揭示了晚期心力衰竭中调节的一组核心通路。

通路分析显示（图中绿色的表示该蛋白在实验检测的结果中是下调的，如果有红色则表示为上调蛋白。方框中的是蛋白质，圆圈节点是代谢物。）：与雌激素信号通路相关的大多数蛋白质在 ICM 和 DCM 中共同调节。然而，我们的数据也揭示了两疾病之间的差异性。例如，钙结合蛋白 CALM2 在 ICM 中上调，在 DCM 中下调。这说明不同的心肌病是存在异质性的，未来或许可以根据心肌病的不同病因提供更精准的治疗。

图4：蛋白-代谢通路分析

04

蛋白质-代谢物相互作用的网络分析

作者接下来对所有蛋白质和代谢物进行了成对的相关网络分析，以识别共同调节的节点。

共同在 ICM 和DCM中，均有许多共同调节的细胞外基质蛋白（紫色）占大多数节点，强调了细胞外重塑在疾病中的重要性。此外还有补体和凝血节点（浅绿色/蓝色）。而DCM与 ICM 相比，细胞骨架（浅橙色）和免疫（黄色）节点的数量较少。

图5：a、b网络分析：说明 ICM 和 DCM 左心室心肌中的功能蛋白（圆圈）和代谢物（正方形）节点。根据功能分类对节点进行颜色编码。

【备注，①size：代表特征向量中心性参数（即该节点对于整个信号网络的总体贡献程度和重要性）；②连接线边宽度：边宽越宽，代表Pearson correlation coefficient越 大，blue代表正相关，red代表负相关，所有连接线的两端的蛋白质表达富集的Pearson相关性系数大于0.7；③两个节点距离：代表两个蛋白质或小分子代谢物的功能相关性】

05

性别-代谢物/蛋白质相互作用

性别-代谢物：

ICM中 具有性别相互作用的顶级代谢物是组氨酸（Histidine），在男性心脏中增加。

DCM中 具有性别相互作用的最高代谢物也是组氨酸。

ATP却在男性心脏中减少。

性别-蛋白质：

ICM 与供体中，有 18 种蛋白质具有性别相互作用：AP1M1在男性心脏中显着减少；FRY 显着降低；X 染色体编码蛋白 HNRNPH2仅在男性 ICM 心脏中显着升高。

DCM 与供体中，有 7 种蛋白质具有性别相互作用：EXOC1 （是一种胞外囊泡靶向所必需的蛋白质）在男性 DCM 心脏中显着升高；ANXA3（沉默导致改善心肌梗死后的心肌修复并显示在早期血管形成中起作用）在男性 DCM 心脏中减少。

图5：ICM ( c ) 和 DCM ( d ) 中的代谢物-性别相互作用， ICM 和 DCM ( e ) 中的蛋白质-性别相互作用。

小结

蛋白质组学和代谢组学的联合分析是一直是多组学研究的一个热点，但由于蛋白质组和代谢组的差异性，其联合分析也是一个难点。

本文展示了目前蛋白质组学和代谢组学联合分析最常用的一种方法，为疾病组织样本和健康对照差异蛋白质组学研究的基础经典思路，按照差异蛋白质识别和筛选→多层次聚类分析→信号与功能通路富集→差异蛋白质功能互作关系分析的步骤对差异蛋白质数据信息进行挖掘，阐明病理状态下的异常生物学现象；

此外，本文亮点在于对【性别】的关注，性别、年龄等人口学基本信息导致疾病样本组织中蛋白质组学或代谢组学表征的差异，尤其是在发病风险和治疗反应性上具有性别年龄特异性的疾病表型中。