【单细胞文献解读】晚期非小细胞肺癌的单细胞图谱

导语

GUIDE ╲

NSCLC (非小细胞肺癌)是一种高度异质性的疾病。癌细胞和周围微环境共同决定了疾病的进展以及对治疗的反应。了解NSCLC的细胞生态环境，有助于指导个体化治疗。

背景介绍

关于NSCLC的单细胞研究，很多研究都关注于早期可手术样本，不能反映晚期肿瘤的细胞特征。今天，小编以2021年5月发表于Nature Communication (IF:12.12)的文章，来梳理一下关于晚期NSCLC的单细胞研究。

数据介绍

• 患者及样本：收集42名晚期（III/IV期）NSCLC的原发灶，共包含18例腺癌LUAD，18例鳞癌LUSC以及6例非小细胞肺癌患者，同时收集了这些患者的病理类型、驱动基因突变情况、吸烟信息等。
• 测序平台：10x Genomics。

结果解析

01

晚期NSCLC的单细胞图谱

42个晚期NSCLC患者，共获得了90,406个细胞，包括癌细胞、髓系细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、肺泡细胞、上皮细胞、内皮细胞、肥大细胞以及滤泡树突状细胞(Fig b-c)。

• 不同患者的基质细胞和免疫细胞倾向于聚类在一起，而癌细胞具有患者异质性 (Fig.d)。
• 不同患者之间的基质细胞比例、免疫细胞比例、癌细胞比例分布不同，可能与不同的肿瘤表型或活检部位有关（Fig.e）。

02

肺鳞癌的瘤间及瘤内异质性比肺腺癌高

利用InferCNV方法推测癌细胞，发现患者存在瘤内异质性和瘤间异质性(Fig.a)。

• 对于LUAD患者，在7号染色体和8q上发现明显的扩增，而在10号染色体上发现明显的缺失。
• LUSC患者在染色体3q出现扩增，5p出现缺失。
• 有已知驱动突变的LUAD患者，出现1q和5p的明显扩增。无已知驱动基因突变的LUAD患者，其CNV图谱与LUSC类似。

虽然癌细胞呈现出患者特异性，但在相同病理亚型的癌症有着类似的癌细胞比例（Fig.b-c）。

基于基因组CNV的瘤内异质性与基于表达数据的瘤内异质性类似（Fig.d）。

根据病理类型和突变信息，将患者进一步分为三组来分析瘤内异质性：有驱动突变的LUAD vs 无驱动突变的LUAD vs 无驱动突变的LUSC。

• 发现无驱动突变的LUSC瘤内异质性最高。
• 在LUAD中，不论是否有驱动突变，其瘤内异质性变化不大。

这些现象说明了影响表型的，不只限于基因组改变。

03

肺上皮细胞的可塑性及其向恶性细胞的发展轨迹

肺泡细胞表达了经典的marker基因(CLDN18, SFTPA1, SFTPC)，可细分为两个细胞亚群均为II型肺泡细胞(AT2)：AT2-1和AT2-2，两个细胞亚群均无I型肺泡相关的基因表达（Fig.a）。

1）AT2-2与正常AT2表型相似，具有常见的AT2标记SFTPA和转运体ABCA3上调（Fig.b）。

2）AT2-1表达了细胞增殖和细胞迁移相关基因，如CEACAM6、KITLG、FOXC1等，提示表型发生恶性变化。

上皮细胞可进一步分为纤毛上皮细胞、棒状细胞和基底细胞(Fig.c-d)。

已有研究发现，LUSC可能是基底细胞和棒状细胞发展而来，因此作者进一步针对基底细胞和棒状细胞、癌细胞绘制分化轨迹（Fig.e），发现基底细胞是棒状细胞转化为LUSC的中间状态。

已有研究发现，LUAD可能由AT2细胞和棒状细胞起源而来，因此作者进一步针对腺癌的AT2细胞、棒状细胞、癌细胞绘制分化轨迹（Fig.f），发现AT2和棒状细胞均可发生成LUAD。

通过LUAD和LUSC的细胞轨迹发现，有些患者的癌细胞在分化的末端，说明肿瘤细胞具有同质性的表型特征。而有些患者的癌细胞在整个癌症分化轨迹中都散落分布，具有多样性和异质性。

04

晚期NSCLC肿瘤微环境中含有丰富的基质和免疫成分

对内皮细胞进一步细分亚群，可分为：淋巴内皮细胞、静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、尖端内皮细胞、富含干扰素诱导基因的内皮细胞。

对成纤维细胞进一步细分亚群，可分为：周皮细胞和成纤维细胞（6个）。

对B细胞进一步细分亚群，可分为：2个B细胞，7个浆细胞。

对髓系细胞进一步细分亚群：可细分为10个细胞。

对树突状细胞进一步细分亚群：包括浆细胞样树突状细胞，I型常细胞样树突状细胞(cDC1, cDC2)，成熟DC细胞。

中性粒细胞可进一步细分两个亚群：不同程度表达潜在的多形核白细胞髓系来源抑制细胞(PMN-MDSCs)相关基因，如LOX-1 (OLR1)。

05

Th17样细胞与Treg之间潜在的互相转化

对T细胞详细分亚群，包括：CD4+ naïve T cells, CD4+ Tregs, CD4+ T helper 17-like T cells (Th17-like), CD8+ effector T cells, CD8+ exhausted T cells, 以及NK-1细胞（CD16+）、NK-2细胞（CD16-）（Fig.a-b）。

NK细胞(CD3D-, KLRD1+, NKG7+)可细分为NK-1和NK-2：

• NK-1中趋化因子受体CX3CR1和成纤维细胞生长因子结合蛋白2 (FGFBP2)表达上调，两者都参与淋巴细胞细胞毒性功能。
• NK-2的组织驻留标记物如CD49D (ITGA1)、CD103 (ITGAE)和ZNF683表达较高。

免疫检查点抑制剂CTLA4和TIGIT富集在CD4+ Treg和CD8+ exhausted T细胞中（Fig.c）,LAG3只在CD8+ exhausted T细胞中表达。

采用Slingshot和Monocle方法，对CD4+ T细胞进行了轨迹分析，绘制其在肿瘤微环境中的发育轨迹。

• Slingshot揭示了Tregs和Th17样细胞之间的过渡性关系，它们均起源于naïve细胞（Fig.d）。
• 由Monocle发现，naïve细胞分化成两个主要分支，Treg和一个增殖的亚群分支(Fig.f)，其中Th17样细胞的代表性转录因子RORC，在由naive至Treg分化轨迹中表达也随之变化，证实了Th17作为naive至Treg的过渡表型。

小结：Treg和Th17样细胞之间存在着复杂而微妙的相互作用，在肿瘤抗原的适应性免疫应答中起到重要作用。

06

NSCLC亚型和ITH共同塑造了肿瘤微环境

为了探索肿瘤亚型及其ITH水平是否影响其微环境，作者比较了不同组织学和驱动突变状态下的细胞类型组成。

比较不同组织学(有驱动突变的LUAD vs 无驱动突变的LUAD vs 无驱动突变的LUSC)：

我们发现所有LUAD患者的中性粒细胞显著减少（Fig.a）。

当比较是否有驱动突变的LUAD患者时，发现一组高表达CCL13的巨噬细胞簇在突变肿瘤组中富集（Fig.b）。

cDC2显示出Langerin (CD207)表达，TCGA生存分析显示，CD207是LUAD的预后标志，而不是LUSC的预后标志(Fig.c)。

探索ITH评分与免疫细胞之间的相关性。我们发现表达的ITH与中性粒细胞、两种亚型的巨噬细胞呈正相关，与浆细胞呈负相关（Fig.d）。该结果说明，患者的异质性ITH越高，更倾向于具有较高的免疫抑制环境，以及较低的癌症杀伤能力。

小结：NSCLC的亚型和ITH水平主要影响髓系细胞，而不是肿瘤浸润淋巴细胞。

07

不同组织学亚型的NSCLC细胞互作分析

探索肿瘤微环境中细胞类型之间的相互作用，发现癌细胞和内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞之间存在显著的相互作用(Fig.a)。

EGFR、NOTCH、WNT等致癌通路与PDGF和炎症信号通路之间存在复杂的相互作用网络，特别是影响TNF-a和趋化因子应答通路(Fig.b)。

肿瘤细胞高表达配体CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8 ，这些配体可以与CXCR1受体、以及中性粒细胞受体CXCR2结合(图6c)。

小编总结

本研究的亮点：将组织学亚型以及是否含有驱动突变等因素考虑在内进行了晚期NSCLC单细胞研究。

Wu F, Fan J , He Y , et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and themicroenvironment in advanced non-small cell lung cancer[J]. NatureCommunications, 2021, 12(1).

END