微生物群对肺内稳态和疾病的作用

原文来自：Wang, J., Li, F., and Tian, Z. (2017). Role of microbiota on lung homeostasis and diseases. Sci China Life Sci 60. doi: 10.1007/s11427-017-9151-1

作为气体交换的地方，肺部不断暴露于环境刺激之下，例如过敏原，微生物和微生物污染物。独立于培养的微生物分析技术（例如16S rRNA测序）的发展，已经发现肺部不是无菌的，事实上，它们被不同的微生物群落所占据。肠道微生物在调节粘膜稳态和防御方面的功能已得到广泛研究; 然而，肺部微生物在调节免疫和体内平衡方面的潜在功能研究才刚刚起步。越来越多的证据表明微生物群与肺体内平衡和疾病的相关性。在这篇综述中，我们描述了呼吸系统中微生物群的分布和组成，并讨论了肺微生物群在健康和急性/慢性肺病中的潜在功能。另外，我们也讨论了对肠 - 肺轴的认识，因为最近几项研究揭示了这种肠道，肺和微生物群的免疫学相互作用。

简介

微生物群代表微生物的复杂集合，包括细菌，病毒，寄生虫和殖民地暴露于外界的身体表面的真菌。微生物群的多样性和组成受到许多因素的影响，包括宿主遗传学，环境因素和宿主免疫力（Rooks和Garrett，2016）。在健康方面，微生物群对新陈代谢，免疫系统的发育和对病原体的保护是有利的，反过来，免疫系统将影响微生物群的组成（Alegre等，2014; Honda和Littman，2016）。

近年来，肠道微生物已成为广泛研究的课题，我们对肠道菌群组成及其潜在功能的认识正在迅速增长。人体肠道栖息着超过100万亿个有益于生理学，代谢，营养和免疫功能的微生物细胞（Glenwright et al 2017年）。肠道微生物群的失衡已与胃肠疾病联系起来，如炎性肠疾病（IBD）和肥胖（Round和Mazmanian，2009）。有趣的是，肠道微生物群也被发现影响其他器官，如脑，肝，肺，导致肠-肺轴概念的诞生（Bird，2012; He等人，2017; Young等，2016）。

肠道微生物群的功能已被广泛研究和认可。但是，我们对身体其他部位的微生物群功能的理解仍然处于起步阶段。显然，皮肤，上呼吸道，和泌尿生殖道也拥有不同的微生物群落以及位点特异性免疫网络参与维持屏障功能和局部免疫体内平衡（Belkaid和Tamoutounour，2016;布鲁贝克和沃尔夫，2017年; Taylor等，2016）。教科书告诉我们“正常的肺没有细菌”。然而，培养独立的微生物鉴定技术表明在哺乳动物肺中存在微生物群落（Bassis等，2015; Morris等，2013）。在人类中，已经在健康供体和慢性肺部疾病患者中鉴定出肺微生物群，肺微生物群的组成与上呼吸道中的微生物群相似，但数量较少，可能是由于暂时进入而不是不同结构的独立群落（Charlson 等，2011）。关于肺微生物群在调节特异性免疫和体内平衡方面潜在功能的研究才刚刚开始。许多问题需要回答，例如肺微生物群的屏障和免疫功能是什么？改变肺微生物群对肺部健康和疾病的影响是什么？使用微生物治疗慢性肺部疾病的可能性有多大？在这篇综述中，我们将描述最近对肺微生物群的理解及其对肺部健康和疾病的相关性。

呼吸系统的生理功能和稳态维持

呼吸系统由一系列器官组成，这些器官负责吸入氧气和排出二氧化碳。为了方便，将呼吸系统人为地分为上呼吸道和下呼吸道两个功能部分。上呼吸道由鼻孔、鼻腔、咽、会厌和喉组成。下呼吸道包括气管、支气管、细支气管和肺。肺的主要功能是将氧气从空气中输送到血液中，并将二氧化碳从血液中释放到空气中。令人惊讶的是，Lefrancais等人最近发现，肺是血小板最终产生的主要部位，约占小鼠血小板总量的50%，这意味着肺是一个具有相当造血潜力的器官(Lefrancais等人，2017年)。肺的呼吸功能决定了其向外部环境开放的结构，这使得肺面临外来物质的持续挑战(Bai等人，2016年；Siu等人，2014年)。然而，令人惊讶的是，即使考虑到肺部巨大的表面积和每天被吸入的大量空气，肺部的炎症反应很少发生(天津等人，2016年；Wissinger等人，2009年)。肺部如何忽视或容忍无害的刺激以防止潜在的致命免疫病发生的？

只有当病原体具有足够的危险性，超过免疫应答的特定阈值时，免疫反应才会启动。免疫反应的阈值是由许多因素决定的，包括环境因素、遗传因素、饮食因素、压力因素、年龄因素，甚至之前的炎症事件。因此，阈值在不同人之间甚至在同一个人的不同部分也有所不同(Shekhar等人，2017年；Snelgrog等人，2011年；Wissinger等人，2009年)。肺部的状况要求免疫反应的阈值更高，以避免过多和过度的炎症反应。为了达到这一目的，肺部采取多个部位特异性的免疫调节策略来抑制炎症。例如，与身体其他部位的巨噬细胞相比，肺泡巨噬细胞--气道主要细胞(>95%)，表达较低水平的mhcⅡ类和共刺激分子，并表现出白细胞介素-10(IL 10)和转化生长因子β(TGF-β)，抑制表型(thepenet al.，1994年)；气道上皮细胞分泌高水平的TGF-β、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以限制DC的反应性和肺泡巨噬细胞的活化(Li和Flavell，2008)；模式识别受体，特别是Toll样受体，在激活天然免疫反应和随后的适应性免疫反应中起着关键作用。研究发现，虽然TLR 4分子在人肺泡和支气管上皮细胞中构成性表达，但它们主要在细胞内而不是在细胞表面表达(Guillot等人，2004年)。

最近，随着独立于培养的微生物分析技术的发展，许多研究发现，除上呼吸道外，包括肺在内的下呼吸道也被不同的微生物群落所殖民(Dickson等人，2016年；Man等人，2017年)。肠道微生物群的研究表明，微生物可以通过调节机体的免疫稳态为宿主提供基本的健康益处(Chung和Kasper，2010)。鉴于肠道微生物对肠道的有益作用，我们不禁要问，肺内微生物是否具有与肠道微生物相似的功能，从而促进肺免疫系统的发育，维持肺免疫稳态？

肺内微生物区系的来源及组成

历史上，基于传统培养的研究和经典教学表明，正常肺没有细菌，这一概念在当代医学中一直存在(diickson等人，2016)。然而，在过去20年中，基于16S-rRNA直接扩增和分析的几种独立于培养的技术已经被开发出来，用于研究环境微生物和人类的微生物区系(SU等人，2012年)。独立于培养的技术的应用揭示了肺部并不是无菌的，事实上，它被不同的微生物群落所占据(西格尔和布拉泽，2014年)。人体内的微生物主要包括六门：Firmicutes , Bacteroidetes , Proteobacteria , Actinobacteria , Fusobacteria , and Cyanobacteria ( Cui et al., 2014 ; O’Dwyer et al., 2016 )。上呼吸道被大量厌氧菌和多于厌氧菌十倍以上的有氧细菌所占据(Bassis等人，2015年；Charlson等人，2011年)。通过对健康成人支气管肺泡灌洗(BAL)细菌的分析，发现肺内最常见的细菌门是Bacteroidetes , Firmicutes , and Proteobacteria。肺中的优势属包括Prevotella , Veillonella , Pseudomonas , Fusobacteria , and Streptococcus( Beck et al., 2012 )。

肺微生物是从哪里来的，肺微生物群与身体其他部位的微生物群有什么关系？采用不依赖于培养的方法，基于RNA/DNA测序或微阵列，研究肺微生物学成分不需要培养单个微生物。然而，考虑到肺微生物群的生物量较低，对肺进行微生物测序是一项技术挑战，而通过支气管镜对肺微生物群进行采样将带来口腔和鼻子污染的理论风险(O‘Dwyer等人，2016年)。采用两种支气管镜采集声门前的标本，然后进行连续支气管肺泡灌洗和下气道保护刷，可减少污染的风险。通过分析口腔冲洗液、支气管肺泡灌洗液(BALF)、鼻拭子和胃吸痰样本中微生物的组成，他们发现，呼吸道内有从上呼吸道到下呼吸道生物量下降的同种微生物，而肺微生物群更接近口腔和鼻微生物(Charlson等人，2011年)，这意味着肺微生物可能呼吸时自上呼吸道而来。此外，肺微生物区系的组成和多样性主要受三个因素的影响：(一)进入肺部的微生物的种类和数量，(二)肺部的微生物消除速度，(三)肺部微生物本身的繁殖率(B黑西斯等人，2015年；Charlson等人，2011年)。

肺内稳态维持中的微生物区系

促进肺免疫系统的运转

对肠道微生物群的研究表明，微生物群通过改善粘膜结构和功能，形成先天和适应性免疫系统，并提供对有害病原体感染的保护(Rooks和Garrett，2016；Zhang和梁，2016)，从而使宿主受益。肠道无菌小鼠相关淋巴组织，包括Peyer‘s斑、孤立淋巴滤泡和肠系膜淋巴结会发育不全(Nakanishi等人，2015年；RoundandMazmanian，2009年)。然而，没有报告表明肺微生物学对肺粘膜相关淋巴组织的发育有类似的影响(Gallach和Kotecha，2016)。为了维持肠道系统的稳态，模式识别受体(PRRs)感知微生物化合物并诱导调节性T细胞(Treg)和Th17细胞的分化(Atarashi等人，2013年；Lochner等人，2011年；Shaw等人，2012年；Song等人，2016年)。同样，肺中的PRRs也能感知肺部微生物区系中的微生物化合物，并将原始T细胞转移到Th1细胞，而不是Th2细胞。在出生前，不健全模式的免疫系统是由Th2细胞主导的。出生后，肺中幼稚T细胞的分化将从Th2表型转变为Th1表型，这将保护新生儿哮喘和过敏性疾病(Lloyd和Hessel，2010年)(图1 A)。无菌和无病原体小鼠对Th2型有免疫反应，并显示出对尘螨引起的过敏性哮喘的易感性(Remot等人，2017年)。粘膜注射脂肽、肽聚糖、LPS或DNA等无害的全菌或组分可诱导Th1免疫反应，并保护小鼠免受哮喘和过敏(Saeedi等人，2015年)。

抑制急性感染的过度免疫反应

如上所述，为了维持肠道系统的稳态和抑制过度的炎症反应，肠道微生物群促进和维持Treg细胞的分化。在肺内，出生后的头两周，细菌负荷增加，细菌门从伽马蛋白杆菌和Firmicutes 转移到Bacteroidetes细菌。微生物区系的变化与肺内Helios阴性Treg细胞的形成呈PD-L1依赖关系。微生物区系的缺失或对PD-L1的阻断，在成年前对过敏原造成了夸张的炎症反应(Gollwitzer等人，2014年)(图1 B)。在我们以前的研究中，我们发现上呼吸道的微生物群也以TLR 2和肺泡巨噬细胞依赖的方式提供保护，防止流感感染所致肺部的致命炎症。TLR 2配体+金黄色葡萄球菌(通常在人上呼吸道定居)启动SPF小鼠，促进具有免疫抑制功能的M2巨噬细胞的分化，从而显著降低流感介导的肺部炎症反应(Wang等人，2013年)(图1 C)。

肺部疾病中的微生物区系

微生物群与肠道健康和疾病的相关性已得到广泛证明。肠道微生物区系失调参与了慢性肠道疾病的发病机制，包括慢性炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)(MacfarLane等人，2009年；Matsuoka和Kanai，2015年)。近年来，肺部微生物区系也被认为是肺部疾病的致病因素，肺部微生物区系的变化将影响疾病风险、药物反应和临床结果(Lynch，2016)。有许多因素，如解剖损伤、病理影响、生理变化和免疫系统缺陷，可能破坏肺微生物群并导致慢性肺疾病(Marsland和Gollwitzer，2014年)，慢性肺病主要包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)和特发性肺纤维化(IPF)。

哮喘

哮喘是一种慢性多因素疾病，被认为是由遗传和环境因素，包括空气污染和过敏原共同造成的(Ghosh等人，2015年)。哮喘在发达国家比较流行，这意味着生活环境通过改变肺部微生物的多样性和组成，对哮喘的病因有很大的影响。Ege等人报告说，在传统农场长大的儿童接触到更广泛的环境微生物，与对照组儿童相比，哮喘的风险较低(Ege等人，2011年)。许多关于哮喘患者的研究已经确定，患者的肺微生物组成与健康对照组不同(Hilty等人，2010年；Marri等人，2013年)。哮喘患者存在较多的Proteobacteria细菌和较少的Bacteroidetes细菌，这可能是哮喘的一个准确的预测因子。因此，肺微粒体的组成和肺微生物与宿主的相互作用对哮喘的发生、发展具有重要意义。

慢性阻塞性肺病(COPD)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性阻塞性肺疾病，其特点是长期气流不佳(Tan等人，2016年；Tan等人，2014年)。许多关于肺微生物区系与慢性阻塞性肺病之间关系的研究发现，轻度和中度慢性阻塞性肺病患者的肺微生物群与健康对照组的肺微生物群相似(Sze等人，2014年)，这与哮喘患者不同，后者即使患有轻度疾病也可检测到肺微生物群的变化(Marri等人，2013年)。只有在慢性阻塞性肺病(COPD)晚期患者中才能发现肺微生物群的变化(Dickson等人，2016年)。在慢性阻塞性肺疾病晚期患者中，Proteobacteria或Firmictutes更多，Bacteroidetes数量较少(Garcia-Nu ez等人，2014年；Wu等人，2014年)，这与哮喘患者微生物群的变化类似(Garcia-Nu ez等人，2014年)。然而，哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)是肺部的不同疾病，这意味着，除了肺部微生物的变化外，其他因素也会导致疾病，并比微生物发挥更重要的作用。

囊性纤维化(CF)

CF是一种遗传性疾病，主要影响肺部。肺部CF综合征表现出支气管扩张和阻塞性肺疾病的进展(Stenbit和Flume，2011年)。肺微生物学与CF发病的关系仍存在争议。在临床稳定和恶化期间，几乎所有年轻CF患者的痰中都能检测到金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等特定的呼吸道病原体(Ramsey，1996)，因此CF的加重一直被认为是细菌感染的结果。然而，一些研究发现，抗生素治疗对疾病进程没有显著影响(Hurley等人，2012年；Smith等人，2003年)。因此，CF的加重与细菌密度的增加或多样性的降低无关，肺微生物学与CF发病的关系可能比我们以前想象的要复杂得多。

特发性肺纤维化(IPF)

IPF是一种慢性致死性重塑性肺疾病，其特征是肺功能进行性下降。有许多证据证明IPF的病因和进展与肺微生物群的变化和细菌感染有关(Folcik等人，2014年；Molyneaux等人，2014年)。与对照组相比，IPF患者的BALF中细菌负担增加，而且在人和小鼠模型中发现的链球菌、肺炎球菌或葡萄球菌分类群的丰度相对增加(Colard等人，2007年；han等人，2014年)。此外，宿主防御和先天免疫在IPF的发病过程中也发挥了一定的作用。TLR 3信号转导缺陷导致异常炎症，并促进IPF疾病的进展(O‘Dwyer等人，2013年)。

因此，很明显，肺微生物区系参与了慢性肺部疾病的病因或/和进展。然而，仍有几个问题有待回答。例如，导致慢性肺病肺部微生物群变化的原因是什么？肺部微生物群的改变是慢性肺病的原因还是后果？同时，随着对肺微生物学与呼吸系统疾病关系的深入研究，对肺微生物群的调控可能成为一种合理而有前途的治疗方法。令人兴奋的是，通过呼吸道途径接触细菌及其产品已经被证明对控制成年小鼠的过敏性气道炎症有帮助。Nembrini等人报告说，肺接触大肠杆菌可通过TLR 4依赖的方式招募γδT细胞(Nembrini等人，2011年)，从而抑制变应性气道炎症(Nembrini等人，2011年)。Hagner等人发现，经鼻治疗农场源性葡萄球菌W 620可以保护小鼠免受卵清蛋白(OVA)和室内尘螨提取物(HDM)诱导的气道高反应性的影响，方法是以TLR 2和NOD 2依赖的方式抑制成熟DC中IL-12的表达(Hagner等人，2013年)。这两个例子为我们提供了一种利用肺部微生物来预防或改变人类疾病进展的可能方法，并且随着对肺微生物的了解的增加，有更多的细菌可以作为靶标。

肠肺轴的概念

微生物群在维持定居器官或组织的稳态方面起着关键作用。然而，越来越多的研究发现，局部微生物群的变化可能影响远端组织的免疫，特别是肠道和呼吸道之间的相互作用(Budden等人，2017年；Scholyermacher和Hoffmann，2007年；TromPette等人，2014年)。慢性肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病和慢性阻塞性肺病，都表现为肠道疾病的一个表现形式，呼吸道病毒感染通常伴随着肠道症状(Keely等人，2012年)，这意味着肠道与肺之间存在着免疫联系，即肠-肺轴。

肠道微生物对肺免疫的影响

越来越多的证据表明，肠道微生物与宿主免疫系统之间的复杂相互作用不仅对肠道局部重要，而且对其他器官或组织也很重要。肠道微生物区系失调与哮喘等慢性肺部疾病的发生发展密切相关。早期肠道微生物群的破坏可能增加哮喘的风险，通过益生菌治疗恢复改变的肠道微生物群可以降低这种风险(Arrieta等人，2015年；Kozakova等人，2016年；Liu和Marc Rhoads，2016年)。此外，肠道微生物区系也具有广泛的抗呼吸道感染的作用(Tamburini和Clemente，2017)。肠道微生物群的减少或缺失将导致病毒或细菌呼吸道感染后免疫反应受损。Ichinohe等人发现，肠道微生物在呼吸道流感病毒感染后产生病毒特异性CD4+和CD8+T细胞和抗体反应中发挥了关键作用(Ichinohe等人，2011年)。Chen等人发现，抗生素治疗使肠道微生物群枯竭，会增加呼吸道大肠杆菌感染后血液和肺部的细菌数量和小鼠死亡率(Chen等人，2011年)(图2 A)。

肺部炎症影响肠道微生物并引起疾病

不断发展的微生物学文献表明，肠肺轴是双向的，类似于一个循环，可以从两端推测。虽然对肺微生物学对肠道微生物和肠道免疫的影响知之甚少，但一些研究表明，肺部炎症可能影响肠道微生物群并引起疾病。在我们之前的研究中，我们发现呼吸道流感感染导致呼吸道和肠黏膜组织的免疫损伤。进一步的研究表明，流感病毒经鼻内途径感染后肠道内不存在流感病毒，从而排除了流感病毒感染并直接引起肠道局部免疫损伤的可能性。最后，我们发现CCL 25/CCR 9轴介导肺源性CCR 9+CD4+T细胞进入肠道，从而改变肠道微生物的组成，引起肠道免疫损伤(Wang e al.，2014)。另一项研究还发现，局部引起的肺过敏反应也可能影响肠道微生物的组成，反之亦然，肠道微生物群的变化支持肺部的炎症(Vita等人，2015年)(图2B)。

常见的粘膜免疫系统

30多年前，McDermott和Bienstock发现供体来源的肠系膜淋巴结B细胞在过继转移后分布在小鼠的粘膜组织内，而外周淋巴结B细胞则只回到原来的位置，这导致了“共同粘膜免疫系统”概念的产生(McDermott和Bienstock，1979)。这表明黏膜免疫系统是一个系统级的器官，免疫细胞在不同的黏膜组织之间相互作用(Gill等人，2010年；Wang和田，2015年)。虽然这个概念是在30多年前提出的，但仍有一些问题有待回答，例如不同的粘膜部位如何相互沟通？在这个过程中涉及到哪些免疫细胞和分子？我们认为，肠-肺轴是普通黏膜免疫系统的一部分，对肠-肺轴的研究和发现将有助于我们更多地了解普通粘膜免疫系统。

结论

随着不依赖于培养技术的出现和发展，肺中发现了微生物，这与肺是一个无菌器官的旧观念背道而驰。与此同时，出现了许多新的问题。有关肠道微生物的研究表明，肠道微生物在局部乃至全身免疫系统的发育中起着关键作用，但没有证据支持肺微生物学具有类似的功能。肺微生物区系的失调与肺慢性疾病有关，但尚不清楚其是否是免疫调节失调和疾病发生或发展的原因或结果。未来，我们可能会形成一个健康的肺微生物学群落，以加深我们对肺微生物学的复杂性及其遗传和代谢潜能的认识，甚至操纵肺微生物群作为治疗慢性肺病的一种潜在的治疗方法。

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