MCE经验贴 | 细胞分选技术 + 免疫细胞流式鉴定方案解析原创

直播间的小伙伴们大家晚上好，然后非常开心呢，能够代表MCE，然后为大家呃介绍一场关于免疫细胞分选与表型鉴定的这个经验总结这样一场直播。嗯，那我将以以下四个方向来进行今天的介绍，首先是关于呃，细胞分选的一个技术的概览。那细胞分离呢，是指呃，根据细胞所具有的一些特性，然后呢，可以这个将特定的细胞亚群从混合的细胞样品当中分离出来的这样的一种技术，那它一般都是呃，针对于某一特定的细胞，然后呢，去进行生化分析，或者是功能分析的一个前提，呃或者是基础，那它是一类这个非常常见的，就是我们进行生物学实验的一个一个生物技术，那它的样品来源呢，进行细胞分选，主要是来源于肿瘤组织，或者是小鼠的脾脏，或者是其他一些生物组织，去提取他们的细胞啊，提取他们的细胞，然后分离成单细胞，然后呢，再进行一个分选，或者是从这个体外的培养细胞，或者是生物的体液，如汗液啊，尿液等等，分离它特定的细胞亚群。

然后呢，呃，第三种呢，特别常见呢，就是从外周血，从血液样本当中去分离呃免疫细胞，或者是去分离循环的肿瘤细胞等等，那常见的我们去进行细胞分选，去进行的呃细胞分选，然后下游的一些实验场景，就是比如说循环的肿瘤细胞的捕获，或者是下游进行干细胞研究，免疫细胞分选，或者是一些稀有的细胞类型的一些研究，分离或者是分或者是呃这个细胞负极血细胞的去红细胞，去白细胞等等。

那细胞分选它根据它的这个技术，呃，主要分成两大类，第一类是就是细胞免疫特性，那这个细胞免疫特性基本上基于单克隆抗体，它具有的特异性和多样性，那它就可以利用单克隆抗体去合理的去组合分离不同类型的，去不同类型的这个细胞，那基于这个细胞物理。的特征去进行分选了，主要是依据呃细胞它的大小，或者是密度，表面电荷吸附的能力，或者是它表面的一些这个抗原的差异等等去进行细胞分选，那总体来说这两个大分类呢，它可以呃应用到的这个技术主要是分成呃，比如说流式细胞仪进行细胞筛选，或者是平平面那种粘附特性的细胞分离，或者是免疫雌株进行分离等等，还有呃还有这种比如说基于补体或者是基于抗体，然后进行细胞溶解。

那基于物理的这种呃细胞物理特征的方式呢，都是基于细胞大小，还有干重密度，或者是细胞的一些呃形状、弹性度等等进行一个分选，那下面呢，我也进行这个细节上的一些这个介绍，那第一个为大家介绍的在这个物理特性性能上的分选技术，指的是呃这个过滤法也称为细胞筛法，那这个呃细胞筛法呢，它主要是使用这种孔径在6.5~8μm的一个细胞筛过滤，然后呢，去除一些体积比较小的白细胞，那这样子就可以分离出比体积比较大的循环的肿瘤细胞，那这个就是基于一个细胞大小的物理特性去进行分选，那循环的肿瘤细胞呢，它其实也包含一些小的一些细胞，它的体积可能和白细胞是一样小的，所以说呢，这种过滤法也叫细胞筛法，它在应用。

的时候的特点就是它可能会容易丢失部分的呃循环的肿瘤细胞，那它的最大特点就是它很便捷啊，然后呢，它的缺点就是这是一种粗处理的一些呃方法。那进一步呢，根据呃细胞物理特性可以进行分选的呢，就是离心技术，去应用离心技术，那离心技术呢，直播间的老师们也很了解，他就是利用一个呃离心机，它在高速旋转的时候，会产生一定的呃离心力，那样品当中它的一些悬浮颗粒呢，就会发生沉降或者是漂浮，然后呢，从而呢使得一些颗粒它就可以进行一个浓缩，或者说呃与其他的一些颗粒分离，那这里的一个悬浮颗粒呢，它可以是呃细胞或者是细胞器，或者是呃一些蛋白，生物大分子，或者是病毒等等，那当这个离心机驱动的时候呢，这个样品溶液就会匀速的去做一个圆周运动，产生一定的向外的离心力，那由于不同颗粒它具有不同的这个呃质量，还有大小、密度，还有形状等等，它就是不同的，所以说在一个固定大小的一个离心场中，它的沉降速。

程度就不同，那最后呢，就会呃，由于这个离心力，然后呢，去造成了一个分离现象。嗯，那在离心技术里面呢，这个主要分成两个非常常见的一个分离方法，第一个是差速离心离心法，那差速离心法呢，主要是通过呃，逐渐去提高离心速度的方法去分离大小不同的细胞器，那起始的这个离心速度是比较低的，呃，如这个图片，当它比如说在一个细胞匀浆当中，它大小的颗粒是一个混悬的一个状态，然后呢，逐渐去提高它的离心力，那其实离心力它比较低的时候呢，呃，比如说1000g去离心10分钟的时候，这个时候比较大的颗粒就会沉降在管底，那在这里呢，它这个首先1000g去分离了细胞核。

然后呢，这个小的颗粒，它就仍然在悬浮在这个上清液当中，那收集这个底部的沉淀，就可以进一步采取更高的这个较高的一个离心的速度，再次去进行一个一个离心。哦，那以此类推呢，这个就会逐渐的这个，比如说在2万G的时候，这个呃，进一步大小的线粒体，溶酶体和过氧化物酶体就会被离心下来，那在8万G的时候就可以离心较小的一些细胞剂，包括高尔基体囊泡，那在15万G的时候，这种超高速离心的状况下呢，去离心的时间更长，三三个小时之后呢，很多一些细微的一些生物大分子，或者是一些核糖体，病毒等等，它就会被超高速离心，就是超速离心的方法离，呃离心下来，那这种方法呢，更多的都是去呃，通过差速离心法去分离一些大小比较悬殊的细胞或者核细胞器，那通过一个差速离心法呢，就可以实现一个细胞器的初初步分离，因为呢，它可能无法区分，就是同样大小和密度的，比如说V体和，高尔基体和，或者是囊泡，这三种是一样的大小和。

呃，大小和密度的时候，它就是只能进行一个初步的分离，那由于各种这个细胞器，它在大小和密度上是相互重叠的，所以呢，就是某一些慢沉降的一些颗粒，就会被快沉降的颗粒就是。

呃裹到了相应的沉淀块块当中，所以就会需要进一步的呃这个更高精度的离心方法去进行分离纯化，那这一点呢，我们指的就是呃密度梯度离心，密度梯度离心呢，很多小伙伴们就是也很了解，各位老师也非常了解，它是通过惰性介质在呃离心管当中形成一个连续的或者是不连续的一个密度梯度，那比较常见的梯度介质啊，包括一些蔗糖或者是点克沙醇等等，在我们MC的呃目录当中呢，我们都可以提供，提供给这个各位老师。那在密度梯度离心当中呢，它分成两个分类啊，那但是呢，它都是将这个细胞的混悬液或者是云浆的这种物质，嗯，就是把它置于这个密度介质的顶部，然后呢，通过离心通过重力。

呃，这种离心场的方式使得了想要分离的东东西进行一个分层和分离，呃，然后呢，这个分离我呃刚才提到了分成两个，一个是等密度沉降和速度沉降。那其中呢，比如说我们先。呃，介绍一下它的这个速度沉降，速度沉降呢，是指这个不同颗粒，呃，它在这个，呃，这个在梯度的一个介质下，比如说从10%~90%的梯度介质下，然后呢，由于它具有不同的沉降系数，呃，产生分离，那具有相同的一个沉降系数的颗粒，它就会处于同一个梯度层当中，那它主要是用于分离密度相近而大小不等的细胞或者细胞器当中，那图片当中分离的就是就是都是膜结构的微囊泡和外泌体这种方式等密度沉降呢，它就是适用于分离密度密度不等的颗粒，比如说细胞和细胞器呢，它会在一个连续的梯度的一个介质中，从5%，然后呢，21%，35%，45%和90%这样的一个等密度的介质当中，然后呢。

通过一个足够大的一个离心力和足够长的一个时间，然后沉降和漂浮到这个相应的这个我们想要分离物质等呃，这个自身密度相等的介质当中，那这样子相应的密度就会停留在那里，达到了一个平衡。它适用于一个不同密度的一个细胞器啊，或者是细胞的一个分离。呃等密度沉降呢，它呃一般是比较这个，这个在一个比较高的一个密度的介质当中去进行，那这个方法呢，最常见的就是去分离一些呃血液样本，呃就是比如说外周血当中去分离单核细胞，那这个呃密度梯度离心的一个方式，它的特点就是成本比较低，呃操作也比较简单，它可能不需要一个非常特别的设备，但它就比较受限于就是呃它就无法对密度相似的多个细胞去进行一个精准的分离，那后面呢，我们也会这个为大家介绍更精确的这种呃分离方法。

嗯，那举一个例子呢，就是呃，关于一个外泌体的分离，它就应用到了超速离心和密度梯度离心，还有这个差速离心的方法，比如说我们在提取细胞上清后呢，我们可以通过差速离心300g去去除了一些活细胞，然后呢，再通过这个2000g，呃呃2000g的这个作用下呢，可以去除这个死细胞，然后呢，在1万G离心的条件下呢，可以去除我们细胞上清叶的细胞碎片，这样差速离心的方法去去除了一些这个大小不一的一些呃物质之后呢，我们就得到了一个细胞上清，那进一步呢，我们想要得到一个外泌体呢，它可能是通过一个密度梯度离心，这样的纯度会更高一些，那密度梯度的超速离心呢，它在10万G到20万G之间，然后在一个密度的一个介质当中，那一般的外泌体呢，它是在这个密度是在1.1。

3~1.19g每毫升，所以呢，它也会富集在这个。呃，这个密度梯度在这一部位的一个一个一个梯度层当中，那右图展示的是一个western blood去鉴定就是将这个密度梯度介介质等分到了这个11等份，然后呢，去进行了一个外泌体的标志性蛋白，Alex这个TSG101等等的这些蛋白的一个westernslo就可以发现，哦，外泌体富集在了这个第7到第8这个。

部分的密度梯度层当中，这样也实现了，就是只要我们提取到这一部分的这个密度介质之后呢，就实现了一个外泌体的一个大量的负极，这个负极呢，也减少了呃，这个杂蛋白的影响，是一个非常纯度非常高的一个提取的一个方式。那进一步呢，再为大家介绍刚才提到的一个这个，呃，单核细胞的一个分离，那单核细胞分离呢，一般都是通过密度梯度离心的方法去分离这个外周血细胞，它也是这种我们各位老师进行免疫学研究的一个非常基本的一项技术，那血液呢，它因为它是具有很多。呃，多种成分的，比如说这个啊，血浆啊，啊血小板细胞啊，白细胞等等，所以说呢，这这个密度梯度离心，它一般应用的都是，呃，这个淋巴细胞的分层液也是一个密度梯度介质去做密度梯度离心，那这样呢，各各种这个血液成分呢，它就会按照它的密度梯度重新进行一个聚集，那最后呢，这个结果上呢，可以看到这个在左侧的图片当中，因为比如说血浆或者是血小板，它的密度是比较低的，所以它最后在离心后呢，就会悬浮在分层液的最上部。

然后红细胞和粒细胞呢，它是密度比较大的，所以它就会处在这个分层液的底部，那我们想要分离的单核细胞PBMC细胞呢，它的密度呢，是稍低于分层液的，所以说它在最后这个分分层液的这个这个界面上是薄薄的一层，所以说通过密度梯度离心法提取这个外周细胞，最后离心后呢，就是去吸收这一吸取这一部分的这个细胞层，然后呢，再进行PBS，呃，洗涤离心，最后得到了我们通过密度梯度分选到的外周血单核细胞。

最后我为大家介绍的是一个这个在这个呃。临床分离细胞或者是单细胞测序上非常呃近些年非常火的一个微流控进行一个细胞，呃，细胞分选，那这个呢，是基于一个流体力学的原理，然后呢，通过一个微流控进行一个大米级的芯片，然后呢去分离的一个细胞，那下图展示的是一个通过微流控细胞去呃这个分析，这个分选这个杀伤性的T细胞的一个设计的一个理念，这个嗯，这个微流控呢，它是通过这个微流控芯片去生成了一个油包水的反应液滴，那每个液滴当中呢，它都含有这个T细胞以及肿瘤细胞，以及就是它双端会。

分别去标记荧光集团和翠美集团的一个太断。那当这个杀伤性性T细胞，就是它的太断没有被剪切的时候，这个荧光集团就会受脆灭集团影响，它的液滴就不会发光，嗯，但是如果说这个液滴当中的T细胞，它是杀伤性T细胞，那它就会分泌颗粒酶B，那颗粒酶B呢，它就会识别，呃，这个前面我说到的这个这个太断，然后呢，就会剪切开这个太断，使得这个荧光集团和催眠集团分开，这样子荧光集团它就会被激活，然后液滴就会发光，然后呢，从而进行了一个微流控，基于微流控的一个杀伤性T细胞的一个细胞分选，然后呢，分选后呢，这个进行细胞回收，然后呢进行一个扩增，去进行下游的这种细胞治疗的一个。嗯，一个一个一个验证和下游的一些临床回输等等，这个是基于微流控进行细胞分选技术，那在第二部分呢，我就为大家继续进行进行一个介绍，嗯，那这一部分呢，我想为大家介绍的是一个细胞雌性的分选技术。

那细胞雌性的分选技术呢，基本上是基于一个细胞表面，它的表面会存在一些蛋白抗原，然后呢，它去与这个连接这种有特异性抗体的雌株相结合的这样的一种细胞的呃分离的技术，那这种基于雌性的细胞分选技术呢，它就是利用了带有这个雌株，然后它去标记抗体，然后呢，这个抗体去标记细胞，呃细胞的这种这种细胞表面标记物的这种潜力，然后呢，结合这种磁场，嗯的这种这种迁移啊，然后呢，它就可以这个这种磁，这种磁铁呢，它就可以这个去迁移标记粒子的能力，那这样的迁移造成了这样的一个细胞分选，那这种容通过这种磁力或者是磁电有。

呃，控制的这种迁移，它在分离抑制细胞群当中是非常，呃这个有用的，并且呢，这也是这个雌激活这种细胞分选的一个基础。那细胞它就可以基于一个呃，就是呃，基于一个管，或者是基于一个柱的一个方法进行一个分离，那它主要分成阳性分选法和阴性分选法啊，那基于一个阳性分选法呢，它是将这个目标的这个目的细胞啊，然后呢，目的细胞呢，它是。呃，我们想要分选出来的这种目的细胞呢，它是被雌株的标记之后呢，然后呢，作为阳性组分去直接分选出来，那这样分选后的细胞呢，就不必去刺，呃，去除我们的雌株，就根据我们的下游实验去进行一个选择，然后可以直接的去。

啊，用于培养或者是后续的操作，那阳性的分选的方法呢，这样子去分选出来的这个我们的目的细胞呢，它可以将这种雌性标记的靶细胞去大量的复复极，那这个这种阳性分选，它的纯度是更好的，特别针对于一些某些就是需要这个负极的稀有细胞，比如说呃，CD4阳性细胞，或者是CD34阳性细胞等等，嗯，回收率也是非常高的。那阴性分选呢，它是基于一个这个雌性的这个抗体，它标记这个非。目的细胞。然后呢，将这个整体的一个细胞，这个混悬液当中去除，我们。不想，呃，不想要得到的这个细胞啊，那这样子这个就是我们就可以去除所有就是我们不想要得到的这个细胞，它适用的范围就是针对于一些这个，呃，这个就是我们想要分选的这个目的的细胞，我们缺乏针对于目的细胞的抗体，那我们就可以通过阴性分选哦，那或者说是这个我们的细胞是不。

嗯，就是不希望它会被激活的，比如说我们想要分选一些T细胞或者B细胞，或者NK细胞，进行细胞功能分析的时候，我们不希望这些免疫细胞被激活，我们就可以选择这个阴性分选，那阴性分选它的特点就是它的步骤会简单一点，然后呢，阴性分选它去除了这些非目的细胞了之后，嗯，这个目的细胞它没有被这个抗体和雌株标记，就不会异常的激活到细胞，所以说阴性分选嗯也越来越得到了我们广大的科研人员的一个青睐。那我们MCE呢，在我们的细胞分选上呢，能够大概提供十余种这个基于阴性分选或者是阳性分选的细胞核，呃呃，这个试剂盒，然后呢，我们MCE的这种免疫雌株的分选的产品呢，是无需分离柱的，并且呢，这个分选的细胞纯度是能够达到95%以上，可以直接用于目集细胞的补获，并且呢，可以我们也有呃这个解离的相应的缓冲溶液啊，最终可以获得没有雌株标记的细胞当中，那我以MCE小鼠的CD4这个细胞阳性的分选试剂和为例，为大家详细的讲一下这个我们的一个操作步骤，呃，那我们如果说我们这个选的是一个小鼠的一个脾脏的细胞，一般去呃会去先去制备它的一个单细胞悬液，那单细胞悬液去制备的。

过程当中呢，也需要一个，比如说红细胞裂解液，然后室温去裂解，5分钟之后，然后我们得到的细胞悬液，然后可以通过一个细胞筛网去过滤，过滤，过滤之后呢，进行一个计数。

然后呢，在我们的试剂盒当中呢，有这个分选缓冲溶液，可以去重选我们的单细胞悬液，去调整我们的细胞密度，在这个10的7次方，10的8次方每毫升左右，然后呢，去取到了我们的细胞悬液的之后呢，可以加入到一个比如说流式管，无菌的这种流失管，然后呢，加入到我们试剂盒当中的一个阳性分选的这个CT4的阳性捕获的抗体，然后呢与抗体混合去进行一个复育，那当我们的细胞和抗体这个在这一步骤去混合复育完成了之后呢，然后呢，就可以在这个呃流失管当中加入到我们试剂核体，当提供的倾斜好的一个磁珠，那这样子细胞抗体和雌株就进行了一个混合的混合，然后呢这样子。

再去啊，富裕10分钟。呃，赋余10分钟之后呢，这个图示当中是画了一个磁铁，我们也可以把它置于一个磁性的分离器当中，这样子是这个在磁性分离器去赋余5分钟了之后呢，我们就是去除了一个上清，然后呢，去除上清了之后呢，这个这个就是我们要去重复的去洗涤雌珠和细胞的这个混合物1~2次，然后呢，将流失管从这个磁力架中当中取出来，然后呢，呃，就是就可以加入到这个，呃就是这个时候我们就是得到了含有雌株的一个我们阳性的分选的这个细胞，然后呢，这个时候呢，在我们阳性的分选试剂盒当中呢，有这个解离的这个缓冲溶液，然后呢，就可以与这个解的缓冲溶液啊，在这个重复的这个解离几次，那这个方法呢，就是通过这个加入解离缓冲溶液之后呢。

然后呢，再磁性的去分离5分钟，然后呢，这样的步骤呢，重复1到两次，然后呢，将上清液呢，去转移到新的流试管当中备用，那这个时候呢，这个上清液呢，就是一个没有磁珠标记的一个这个CG4的细胞，那在这个解离的这个缓冲溶液，就通过这个磁性分离器就将我们的雌株分离开来，然后呢，根据实验的需要，我们去洗涤最后的细胞之后呢，就可以将细胞重选到我们的缓冲溶液或者是培养基当中，就可以用于后续的分子生物学或者是细胞生物学的实验当中，这个是免疫雌株分选方法，那免疫雌株分选方法呢，它的特点就是呃，非常的快速啊。

那下面呢，也为大家介绍一个更常见的一个流式细胞的一个分选方法。那刘氏分选的这个这个一些基于它的一个原理呢，就是直播间的各位老师们也很了解，它是基于一个荧光基团标记的抗体，然后它与细胞富裕之后呢，可以这个进行一个标记，那这样子标记好的这个细胞悬液呢，它就是。呃，就是可以这个放到这个我们的流失管当中，然后呢，通过高压去这个压入到流动室当中，那这个流动式呢，这个流式细胞仪的这个流动式当中就会充满了鞘液，那在鞘液的一个包裹还有一个推动的下呢，就会把我们的细胞去列成了一个单单裂，以一定的这个速度从这个流动式的喷口就可以喷出来，然后呢，在流动式的喷口呢，一般会。这个配有一个超高频的一个压电的晶体。

那这个晶体呢，就是在充电之后呢，就会震动，使得这个呃液流它就会断裂成单个的，呃这个均匀的液滴，那这个带侧细胞呢，就会被分散到这些，呃这个分散到这些液液滴当中，那这些液滴呢，就会这个充以不同的正电或者是负电，当当液就是流到了这个偏转板。时的时候，在高压电场的一个存在下呢，就是它就可以这个发生一个偏转，然后呢，落入到各自的一个收容的一个容器当中，那没有充电的液滴呢，就会被落入中间的一个肺液的容器，从而实现了不同的特点的一个呃细胞的一个分离。这是基于流式的一个细胞分选分选数，那进行流式分选的时候呢，比较困难的呢，就是关于呃抗体偶联荧光素的一个选择，那很多老师呢，都会遇到这种状况，就是我们已经确定好了我们要分选的细胞的一个marker，但是偶联的细胞素是不知呃荧光素是不知道怎么选的，那一般来说呢，都是这个基于呃三个原则，第一个就是我们需要根据我们的流失细胞仪的仪器的配置去选择荧光素，那我们就是要多色的去标记荧光素的时候，搭配的时候呢，每个通道呢，只能选择一种荧光素，那各个通道之间的荧光素呢，就是就实现了一个互相的搭配，第二点呢，就是根据我们想我们的那个抗原，它的一个表达的强弱去合理的分配荧光素，比如说抗原，它是高表达的话呢，可以与。

低荧光强度的这个荧光素的抗体相结合，第3个这个最重要的就是我们要选择光谱重叠小的荧光素。这是因为就是呃，这个荧光素它是光宽的一个发射谱，这个特点呢，就导致了就是荧光的通道之间可能会产生一些光谱重叠的现象，那所以呢，我们这个进行多色的荧光素组合的时候，就要将这个光谱重叠的可能性降到最低，那多色的流，呃，这个流式实验的时候呢，往往就是需要我们通过一些补偿的调节去消除光谱重叠的一个影响那。

呃，在这里面呢，在为大家这个总结一些流式分选的一些这个tips，就是因为我们在分选的时候，如果说我们的细胞还需要继续的培养的时候，我们就需要保证我们的样本是一个无菌的状态，然后呢，在固定的时候呢，就是就是不能使用固定剂去固定细胞，因为如果我们想要得到的活细胞，它在被固固定剂处理之后呢，就会死亡，那细胞重悬液呢，也可以加入一些这个PH调节剂等等。

还有我们流逝的一些鞘液当中呢，也要避免含有一些抑菌剂，呃如一些乙醇胺类的一些物质，那如果说我们提到我们细胞分选之后呢，还需要再次培养，就需要含有这个准备，我们含有血清的一些这个收集管，保证我们的呃分选完毕了之后，那个血清的浓度是大于5%的，嗯，然后呢，在流式分选前呢，我们如果需要去除死细胞，不影响后续实验的前提下呢，也可以呃用一些核酸的一些这个这个这个PI或者是dpe去去除我们的这个呃死细胞。那流式分选当中呢，首先第一个就是我们需要去制备单细胞悬液，然后呢，进行细胞染色，然后呢，再进行细胞分选，后续进行细胞的一个培养的啊，或者是进行细胞的一个分析，然后呢为大家去呃这个。

去总结一下我们细胞分选技术，呃，流式分选和雌株分选它的一个分别的一个特点，那比较常见的一个分选技术呢，实际上是免疫雌珠的分选，那一般来说，如果我们雌珠分选能够达到我们的研究要求的话，就可以首选雌珠分选，那如果当词猪分选它不能够达到要求的时候，就可以考虑流式分选，那这种两种方式它实际上是各有优劣的，就取决于呃各位老师的下游应用，那相较于比较复杂的流式分选的磁珠分选，它实际上是不需要非常昂贵的设备和耗材的，并且它的操作也是比较简单的，像我们MC就有相应的试剂盒，它的分选速度特别快，那此外呢，流式分选呢，它可能会对细胞产生一些刺激，从而影响到了细胞活性和后续的应用。但是雌株分选呢，它就是对细胞的影响就可能要小得多。

那如果说我们需要根据包内的指标，然后呢，还有多个marker去进行细胞分选的时候呢，这个时候流失分选可能是更好的一个选择，当然呢，流式分选和磁珠分选呢，它也可以结合使用，从而达到了一个事半功倍的一个一个一个效果。最后呢，为大家介绍一下子关于我们的免疫细胞表型和它的功能鉴定相关的一些实验，那免疫细胞呢，它这个在血液当中或者是相应的免疫器官当中是大量的分布和占有很高的一个比例的，所以我们就是呃，需要选择相应的免疫细胞相对负极的样本去进行单细胞悬液的制备，那在直播最开始呢，我也为大家介绍了，就是在我们制备免疫细胞的样品制备的时候，一般都是来源于外周血，或者是骨髓，或者是免疫器官，比如说脾脏等等。

嗯，那分别去它的相应的样本制备呢，就是包含一些这个特点，比如说第一个这个外周血，那外周血单细胞悬液的时候，制备的时候，无论是我们想要采集人的或者是鼠的外周血的时候，这些样本都需要去保存到这个抗凝管当中，那一般可能选择这种就是肝素或者是e dta的抗凝管，然后呢，在室温下去保存那血液样本，如果我们在离体的时候，建建议就是两个小时之内处理的时候，处理效果是最佳的，如果是不能及时处理的话，我们在四度保存我们的血液样本，然后呢去使用抗凝管。嗯，那一般外周血去提取的免疫细胞的时候呢，会涉及到一个裂红，就是通过红细胞裂解液去裂解红细胞，那裂红时间一般建议在5分钟到15分钟之这个之间，如果是呃，进行一个淋巴细胞的表型鉴定的话呢，就是选择的裂红方式呢，这个就是非常简单又省时，不影响白细胞的形态，但是就是需要注意裂解时间。

第二个就是从骨髓当中去去去分离啊，这个方法呢，一般都是基于这个这个小，我们进行一个小鼠实验，然后呢，小鼠实验呢，我们从这个小鼠的肌肉组织可以分离出它的股骨和胫骨，然后呢去除这个股骨和胫骨的末端，然后呢通过一个针头。这个针头里面含有培养基的方式去冲洗我们的这个，呃，冲洗小鼠的小鼠的骨髓，然后呢，呃，将这个骨髓细胞通过这个细胞的过滤器进行一个过滤。然后呢，加入红细胞的这个裂解液，再去重悬，然后离心啊，1500板转离心5分钟，这样去这个气上清就会得到相应的骨髓细胞哦，那如果是进行淋巴细胞的一些功能鉴定，比如说细胞因子分泌实验，或者是刺激培养当中呢，下游也可以选择一些密度梯度离心的方式去分离目的的我们的目的的细胞群，再进行下游的实验，可以减少一些干扰。

嗯，然后第三个就是比较常见的一个提取的免疫细胞的方式，就是通过脾脏，这个脾脏是位于一个横膈膜的这个正下方，就是是我们人体最大的血液的过滤器，那它是由，呃，这个结缔组织和这个淋巴样组织就是构成的，那脾脏作为一个免疫器官呢，它就是。嗯，主要是由免疫细胞组成的，所以说这样我们也通过这个提取脾脏细胞的免疫啊，脾脏器官的这个免疫细胞呢，是它的这个含量是非常大的，它常见的方法呢，也是呃，去制备一个单细胞的悬液。嗯，进行一个这个相应的，比如说在12个小时之内去处理样本，嗯，然后呢，如果说组织是脾脏的时候呢，研磨法处理之后呢，就是也可以进行一个裂解的红细胞，然后去离心，呃，洗涤去除了红细胞碎片了之后呢，去重悬到这个单细胞的一个悬液。

那一般来说呢，我们这个在脾脏当中，首先要先进行剪碎，然后呢进行一个研磨，然后呢，呃，一定程度上我们也可以选择一些这个蛋白酶去进行一个消化，那分选过后的这个这个。细胞，或者说我们分离得到的这些这个免疫细胞的样本呢，就是需要一个细胞的计数，后续再去进行一个表型的鉴定，那分选的细胞，比如说一个脾脏呢，往往就含有10的八次方格细胞，嗯，然后呢，这个我们在进行表情鉴定的时候呢，就会去应用到前文提到的流式细胞1啊，那如果我们如果说不不对这个细胞进行计计数，然后呢，直接就去取了单细胞悬液，然后呢就去染色，就可能导致我们抗体的染色效率就直线下降了，那一般我们推荐呢，呃，这个技术呢，一般是在10的6次方到10的七次方每毫升。

然后呢，针对于样本的细胞基数是一定要去。进行的一项工作，那个人比较推荐，每个样本我们的细胞数在10的6次方左右是最佳的，然后呢，如果我们进行下游的分选之后呢，就是就是。要立刻的对细胞进行分型鉴定，就不用通过一个这个细胞活力的一些死活染料，那如果说我们是通过冻存的方式，这个呃，再去进行表情鉴定呢，就是建议要加入到这个呃死活染料，然后呢，再去进行一个细胞上机。

那在免疫细胞当中呢，这个就是微环境当中呢，免疫细胞呢，它还有T细胞，还有B细胞，还有NK细胞，树突状细胞等等，还有还有这个巨噬细胞等等，它都是构成了免疫微环境，那流失细胞数呢，去鉴定这个细胞表面的标记物，进行表情鉴定呢，是这个最常见的一个方式啊，那这个不同的免疫细胞，它的细胞表面的标记物当中，它也反馈了，反映了它的一个功能当中，那在这个前文说到的细胞分选的时候，也涉及到了，在飞行鉴定的时候，我们就需要通过这些免疫细胞它所具有的呃呃，这个细胞的标记物，然后呢，去进行这个这个流失细胞数的圈门逻辑的一个设呃设置，那需要注意的是呢，分型鉴定后的这个细胞，如果需要体外扩增培养的时候呢，我们就不能选择一些包内的标记物，嗯，这是因为这个包内检测呢，需要。

要对这个细胞进行一个破膜的一个处理，那可能这样子就得到死细胞，那一般来说呢，我们的染色的体积是不变的，那抗体的用量就不呃不变，那染色体积增加，我们就需要去增加抗体用量，去保持这个抗体的浓度的一个稳定，一般染色体积在50~100μl，然后抗体的富育时间呢，最常见的是一个四度，在30分钟到60分钟之间。这样也可以减少一些非特异性结合，那荧光呢是比较稳定的，呃呃，就是它不易脆脆灭的，嗯，在这个圈门分析当中呢，就是我们需要这个首先通过就是SSC和FFC这个呃，侧向散射和前向散射去对这个我们的样品细胞首先进行一个这个圈门，然后呢，去除粘联细胞，嗯，然后呢，再通过我们的死活染料或者是CD45，对活性良好的CD45的阳性细胞进行一个下游分析，那这一步骤CD45呢，是因为就是红细胞或者是血小板，还有一些成纤维细胞，它是CD45阴性的啊，是不表达或者是弱表达CD45的，所以说这样通过CD45首先进行一个主要亚群的一个划分之后，我们才能在门内在下游的一些其他的。

特异性的标注物进行更精细的分析，比如说单核细胞，巨噬细胞等等，它有相应的这个呃。这个下游的特异性的标志物。然后呢，这是一个这个免疫细胞的一个表情分析，那最后再为大家介绍一下子免疫细胞的一个功能鉴定，那基于免疫细胞的功能鉴定呢，一般都集中在增殖能力，或者是免疫细胞它的细胞因子的分泌的状况，还有一些基于免疫细胞它具有的杀伤性功能，还有调节性T细胞的一些这个呃，抑制实验，比如说基于增殖实验当中，我们可以通过MTT或者是CCK8的方法去检测细胞的代谢活性，然后呢，去反映这个细胞的这个免疫细胞的增殖能力，也可以通过一些这个荧光染料，比如说CFSE的荧光染料去标记，然后通过流失细胞数的方法去观，呃，观察我们的免疫细胞的分裂能力，去动态的追踪增值能力，也可以通过一些这个核酸染料的一些插入的方法，然后去标记DNA的合成，然后去检测SS7这个免疫细胞的比例。

那第二个这个免疫细胞功能鉴定就是鉴定通过相应的伊莱萨或者是呃伊莱萨的方式去检测培养上清当中的细胞因子，然后呢去呃分析，那通过流失的方法呢，也可以去这个分析到相应的一些这个细胞胞的细胞胞内或者是细胞包外的一些细胞因子去进行亚群鉴定，嗯，杀伤功能呢，是这个免疫细胞也是特有的一个功能鉴定的方法，可以通过比如说荧光标记靶细胞的方法，然后呢去分析这个。

呃，免疫细胞它的特异性的杀伤能力，或者是去检测这个颗粒酶B啊，或者穿孔素的一些检测，然后呢，检测它免疫细胞分泌的一些细胞毒性分子，那最后呢，这个在这个T细胞调节性体细胞与效应T细胞共培养的时候呢，也可以检测效应T细胞它的增殖能力，或者是细胞因子的分泌的抑制率，然后呢，这个是免疫细胞比较常见的一些功能鉴定，然后呢，今天的这个。