一切看淡，一切随缘

摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promeg

人来到这个世界上，

只有两件事：生和死。

一件事已经做完了，

另一件你还急什么呢?

是人，都有七情六欲。是心，都有喜怒哀乐，这些再正常不过了。别总抱怨自己活的累，过的辛苦。永远记住：舒坦是留给死人的。

苦，才是生活。累，才是工作。变，才是命运。忍，才是历练。容，才是智慧。静，才是修养。舍，才会得到。做，才会拥有。

人生，活得太清楚，

才是最大的不明白。

有些事，看的很清，却说不清；有些人，了解很深，却猜不透；有些理，很想不通，却行的通。

总想世界纯澈，却事与愿违，总想事情圆满，却不随心愿，总想人心纯粹，却是一厢情愿...

今后：有缘，不推，无缘，不求。来的，欢迎，去的，目送。一切随缘，顺其自然。

人到了一定年龄，

渐渐地悟透了一些东西。

记住，宁可装傻，也不要自作聪明宁可辛苦，也不要贪图享乐。宁可装穷，也不要炫耀财富。宁可吃亏，也不要占小便宜。

宁可平庸，也不要沽名钓誉。宁可自信，也不要盲目悲观宁要健康，也不要功名利禄。宁可勤奋，也不能无所事事。

世上，没有不快乐的人，

只有不肯让自己快乐的心。

现实看淡了，悲伤骨感。人情看淡了，烦恼不填。缘分看淡了，随心聚散。

是非看淡了，计较变浅。成败看淡了，顺心自然。得失看淡了，自在坦然。

这辈子，和谁过，

怎样过，过多久？

有人因为爱情，有人因为物质，

有人因为容貌，有人因为前途。

而当这日子真的要和选择的人一起过了，你才明白：钱够花就好，容貌不吓人就行。

其实真正幸福的标准，无需理由，很简单，只要笑容比眼泪多，你就找对人了。

人这一辈子：

别太真，别太假，

别太痴心，别太傻。

别太精，别太蠢，

别太善良，别太滑。

简简单单做人，无愧于心；本本分分做事，不欺于人。

坦坦荡荡的活着，对得起自己的良心；有情有义的活着，不辜负别人的真心！

一生有多长，也不过三万天；永远有多远，回头看看已走过一半。

走过坎坷，才知平安就好；尝过酸甜，才知平淡就好；历尽兴衰，才知知足就好；费尽思量，才知糊涂最好。

一辈子不长，

用心甘情愿的态度，

过好咱下半辈子的平凡生活。

无论您有多忙，请花1秒钟的时间把它放到你的圈子里！可能您的朋友就需要！谢谢！

28度热能裤，一穿就热七八度，抗寒过冬，到哪都能扛得住。