线虫行为实验专题（13）丨线虫暴露模型及相关行为监测

以聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）和镉（Cd）单独及联合暴露为例探究对大肠杆菌生长及其作为食物源对秀丽隐杆线虫生理与行为表型的影响。

实验处理组

1. 空白对照组（Ctr）

2. 聚苯乙烯纳米塑料单独暴露组（PS-NPs, 0.01 mg·L⁻¹）

3. 镉离子单独暴露组（Cd, 0.5 mg·L⁻¹）

4. PS-NPs与Cd复合暴露组（PS-NPs + Cd）

各暴露浓度依据环境中PS-NPs和Cd的实际检出水平设定。所有处理均在LB液体培养基中进行。

大肠杆菌OP50生长曲线测定

将大肠杆菌OP50菌液以2%接种量加入各处理组的LB培养基中，充分混匀后置于37 °C、180 r·min⁻¹摇床中振荡培养。分别在培养0、3、6、9和12小时后，使用紫外-可见分光光度计在600 nm波长下测定菌悬液的吸光度（OD₆₀₀），用于绘制生长曲线，评估PS-NPs和Cd对大肠杆菌增殖的影响。

暴露后大肠杆菌的收集与清洗

为确定最佳喂养时间点，分别在暴露0、3、6和12小时后收集各组大肠杆菌菌液（50 mL离心管，5,000 r·min⁻¹离心10 min），弃去上清液。沉淀用无菌水洗涤3次，重悬后作为食物来源喂养秀丽隐杆线虫。后续表型测试根据子代数量变化结果，选定最适暴露时长用于正式实验。

秀丽隐杆线虫的培养与同步化

秀丽隐杆线虫在20 °C恒温条件下，于NGM平板上培养，常规喂食大肠杆菌OP50。为获得年龄同步的线虫群体，采用NaClO/NaOH溶液裂解成熟成虫以释放卵，收集并孵化卵24小时，得到L1期幼虫。

将同步化的L1期幼虫转移至预先铺有经上述处理的大肠杆菌的NGM平板上开始暴露处理，避光放置于20 °C恒温培养箱中继续培养。此后全程使用相应处理的大肠杆菌喂养线虫，直至完成各项表型检测。

线虫行为与生理表型评估

1. 头部摆动与身体弯曲频率测定

取暴露后的成虫，用M9缓冲液冲洗干净，移至含100 μL M9缓冲液的新NGM平板上，静置恢复1分钟。记录单条线虫在20秒内的：头部摆动次数：头部从一侧最大偏转至另一侧为一次；身体弯曲次数：身体沿长轴形成一个完整正弦波形为一次。每组检测15条线虫，独立重复至少3次。

2. 咽泵运动频率测定

将线虫转移至接种了正常OP50的NGM平板上爬行30分钟以适应环境，随后在显微镜下观察并计数其在20秒内的咽部收缩次数（即咽泵运动）。每组记录15条线虫，重复≥3次。

3. 存活率与平均寿命测定

将同步化后的L1期幼虫接种至各暴露体系中，在产卵期间每隔24小时更换一次平板，直至停止产卵。将首次产卵日定义为成虫起始日（t = 0）。每日观察并记录线虫存活状态：用挑虫针轻触虫体，若无任何运动反应则判定为死亡。

存活率 = （总虫数-死亡虫数）/总虫数 × 100% ；平均寿命 = 所有线虫存活时间之和/总虫数，每组测试20条线虫，实验重复至少3次。

4. 子代数目测定

从各处理组中随机选取20条成虫，单独转移至铺有正常OP50的NGM平板上（每板1条虫），定期更换平板以分离后代。统计每条线虫在其生殖期内产生的已孵化子代总数，取平均值。实验独立重复不少于3次。