单克隆抗体分子量测定的常用方法

来源:生物制品质量分析

单克隆抗体（单抗）作为生物制药领域最重要的治疗药物之一，其质量控制至关重要。分子量测定是单抗药物研发和生产过程中必不可少的关键分析项目，直接影响药物的安全性、有效性和一致性。本文将简单介绍单抗分子量测定的意义、常用技术方法及其比较，为生物制药从业者提供技术参考。

意义

结构确认是分子量测定的首要目的。典型的IgG型单抗理论分子量约150kDa，其中重链约50kDa，轻链约25kDa。通过分子量测定可以验证抗体是否按预期正确组装，是否存在翻译后修饰（如糖基化）或意外降解。聚集体分析是分子量测定的另一关键应用。单抗药物在生产、储存和运输过程中可能形成二聚体、多聚体甚至更大的聚集体。这些聚集体不仅可能降低药效，更可能引发不必要的免疫反应，而准确测定不同大小聚集体的分子量及含量分布是控制这一风险的前提。工艺变更评估也需要依赖分子量测定。生物药生产过程中任何工艺变更（如细胞培养条件调整、纯化方法优化）都可能影响最终产品的分子量分布。通过对比变更前后产品的分子量特征，可以评估变更的合理性及其对产品质量的影响。稳定性研究同样离不开分子量监测。分子量的异常变化往往预示着产品的降解或聚集，是稳定性预警的重要指标。

常用方法

分子量测定常用的方法包括凝胶渗透色谱（GPC）、尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）、毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）和质谱法（MS）等。

1. 凝胶渗透色谱（GPC）

凝胶渗透色谱（GPC）属于尺寸排阻色谱，以多孔性填料或凝胶作为分离介质，样品通过色谱柱后，较大的分子被排除在孔外，因此洗脱较快，而较小的分子则穿透孔隙，洗脱较慢，因此分离出的样品可按分子量大小依次流出色谱柱。需使用已知分子量的标准品（如聚苯乙烯、葡聚糖）建立校准曲线，通过校正曲线，从谱图上计算出分子量与分子量分布的信息。该方法适用于聚合物、蛋白质的分子量分布分析，需使用分子量标准品，所测分子量为相对分子量。

2. 尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）

尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）是一种结合了尺寸排阻色谱（SEC）和多角度激光光散射（MALS）技术的分析方法。样品经过色谱柱将单抗分子及其可能存在的聚合物、片段等杂质分离，之后按照分子量从大到小依次流出色谱柱并进入MALS检测器。MALS检测器通过多个角度（如15°、30°、90°等）检测散射光的强度。根据瑞利散射定律，散射光强度与分子量、浓度等因素相关。通过测量不同角度的散射光强度，结合浓度检测（RI或UV）及已知的光学常数和溶剂参数，可以计算出单抗分子的绝对分子量。SEC-MALS 可以直接测定单抗的绝对分子量，无需依赖校准曲线，避免了因校准标准不准确而导致的误差。除了分子量外，SEC-MALS还可以提供单抗的浓度、分子量分布宽度、均方根半径等信息，有助于全面了解单抗的物理化学特性。适用于蛋白质聚集体、寡聚态分析（如单抗单体、二聚体），但其设备复杂，检测成本较高。

3. 毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）

毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）广泛用于单抗的纯度和分子量检测。首先蛋白质与SDS结合使其表面带均匀负电荷，屏蔽电荷对迁移速率的影响，之后在电场驱动下，样品在毛细管中迁移，迁移速率取决于分子大小，小分子迁移快，大分子迁移慢。通过紫外检测器（UV）或激光诱导荧光检测器（LIF）等检测手段，记录单抗分子的迁移时间。根据已知分子量的标准蛋白质的迁移时间建立校准曲线，从而确定单抗的分子量。CE-SDS的优势在于分离效率高，分辨率高，能够快速分析单抗的分子量和纯度。样品用量少，适合微量样品的分析，且可以进行自动化操作。然而，CE-SDS也存在明显局限。作为相对分子量测定方法，它需要与标准品比对来确定分子量，准确性依赖于标准品的质量和匹配度。此外，SDS可能影响某些蛋白质的构象，导致迁移行为异常。

4. 质谱法（MS）

质谱法（MS）广泛用于分子量的测定，首先将单抗分子离子化，这些离子进入质谱仪后，根据质荷比（m/z）进行分析。通过计算单抗离子的质荷比和电荷数，可以确定单抗的分子量。质谱法（MS）灵敏度高且分子量测定范围宽，可以准确测定单抗的完整分子量以及其不同修饰形式的分子量变化。但是仪器设备昂贵，操作和维护成本高。

方法比较

四种分子量测定方法的比较见下表：