Mosaic-RBD纳米颗粒诱导广谱中和抗体，Beacon多重检测快速表征筛选

在对抗SARS-CoV-2感染时，治疗性单克隆抗体（mAbs）会随着刺突碱基的不断替换，结合能力降低，从而变得不再有效。为了能够诱导产生针对保守受体结合域（RBD）的抗体，用于保护免受SARS-CoV-2相关变种和sarbecovirus的侵害，加州理工大学的研究者开发了Mosaic-8b RBD-纳米颗粒疫苗，在60-mer纳米颗粒上随机展示八种sarbecovirus的RBD。在刚刚发布的数据中，研究者使用Beacon单细胞光导系统的多重抗原特异性测定来分析由Mosaic-8b纳米颗粒在兔子中诱导的IgGs的抗原反应性，评估其交叉反应性，并筛选出具有广谱交叉结合能力的抗体。

研究结果

1、Mosaic-8b RBD纳米颗粒疫苗

诱导产生交叉反应性抗体

研究者利用Beacon单细胞光导系统的多重&多轮抗体检测能力，评估Mosaic-8b RBD-NPs在兔子中诱导的单克隆抗体的广泛结合能力。兔子在经历Mosaic-8b或SARS-2 RBD-纳米颗粒进行初免和加强免疫后，分离PBMCs。富集IgG+记忆B细胞，并培养激活IgG分泌。使用Beacon单细胞光导系统筛选约27,000个激活的记忆B细胞。在Beacon上开展连续四轮检测，每轮使用四种荧光团多重测定，最终评估IgG分泌和对12种抗原的结合（图1b），从而能够分析B细胞的广度（图1c）。通过Beacon集成软件和手动验证，用NanoPen上方的通道中荧光“bloom”来评估每种抗原的结合（图1d）。

多重检测实验的结果显示，与SARS-2免疫相比，使用Mosaic-8b进行免疫可使识别一系列匹配和不匹配受体结合域（RBDs）的B细胞百分比更高，而SARS-2免疫则使识别对应的SARS-2 Beta RBD的B细胞百分比更高（图1e）。此外，与SARS-2免疫相比，Mosaic-8b免疫可使识别多种RBDs（即具有广泛交叉反应性的单克隆抗体）的B细胞百分比更高（图1f）。从Mosaic-8b RBD-NP免疫兔子样本中导出90个分泌IgGs的B细胞，这些IgGs能够结合12种测定抗原中的任何一种，首先导出分泌结合>6种抗原的IgGs的细胞，然后是分泌结合较少抗原的IgGs的细胞。最终对分离的14个RBD结合mAbs的配对重链和轻链基因进行重组表达。

图1. 表征兔子记忆B细胞分泌具有广泛交叉反应IgG的特征。(a) 多重检测评估IgG结合广度。单个B细胞在NanoPen中分泌的抗体被抗兔IgG珠子捕获，并用与FITC偶联的抗兔IgG二抗或用不同荧光素标记的抗原检测。(b) 四轮单B细胞筛选检测，每个检测都评估IgG分泌（FITC）和对三种不同抗原（分别标记为TR、Cy5或PE）的结合。(c) 一个多重结合检测的视野图像。(d) 根据在中NanoPen上方通道中的“blooming”来判断对应单克隆抗体的抗原结合情况。被判定为对广泛抗原结合呈阳性的单B细胞被导出。(e)在单细胞多重检测中比较用mosaic-8b RBD-NP或SARS-2 RBD-NP免疫的兔子的B细胞，每个RBD结合的含有单个B细胞的IgG+ NanoPen的百分比，以及(f) IgG+ NanoPen中分泌的IgG识别1到11个RBD的百分比。

2、兔mAbs具有广泛交叉反应特性

本研究通过ELISA检测了由Mosaic-8b RBD-纳米颗粒诱导的兔单克隆抗体对多种sarbecovirus RBDs的识别能力，发现部分单克隆抗体具有广泛的结合能力（图2）。进一步通过竞争ELISA鉴定出这些单克隆抗体在SARS-2 RBD上的表位，其结果与之前研究一致。此外，使用假病毒中和实验评估了这些单克隆抗体的中和效力和广谱性，发现M8b-A10和M8b-C9在测试的病毒系列中表现出较好的效力和广谱性，而Pemgarda对Class 2的sarbecovirus的结合能力较弱，提示其可能对Class 2的sarbecovirus的溢出事件无效。

图2.从接种Mosaic-8b的兔子中分离出的单克隆抗体对SARS-2和其他sarbecovirus具有广泛的识别能力。(a) 通过ELISA检测从接种镶嵌-8b RBD-纳米颗粒的兔子中分离出的单克隆抗体对RBD结合的广谱性。(b) 竞争ELISA用于鉴定单克隆抗体的表位。(c) 兔单克隆抗体对包括SARS-2 D614G、五种SARS-2 VOCs、三种非SARS-2 sarbecovirus和两种嵌合刺突假病毒在内的12种假病毒的中和作用。

3、DMS揭示了多个RBD表位

通过深度突变扫描（DMS）技术，研究者们对五种兔单克隆抗体（M8b-A10、M8b-B1、M8b-B8、M8b-C9和M8b-C10）所靶向的RBD表位中的关键氨基酸残基进行了详细分析。结果显示，这些单克隆抗体的表位逃逸特征与其在ELISA和中和实验中的表现以及竞争ELISA的表位分类高度一致。例如，M8b-A10和M8b-C9对特定残基（如378、411、413和427）的替换较为敏感，而M8b-B1则对可能引入N-糖苷的残基替换较为敏感。这些发现有助于深入了解这些单克隆抗体的结合特性和中和机制。

4、3D结构解释单克隆抗体的特性

研究者通过解析兔单克隆抗体Fab片段与SARS-2刺突蛋白复合物的冷冻电镜结构和晶体结构，深入分析这些抗体的识别和中和机制。研究发现，这些单克隆抗体通过不同的RBD构象识别模式与其结合，且其结合足迹和表位特征与之前的竞争ELISA和DMS结果一致。这些结构分析不仅揭示了兔单克隆抗体的结合特性，还为设计更有效的疫苗和治疗策略提供了重要的结构基础。

5、跨物种Class 1/4单克隆抗体特征

研究继续探讨了不同物种（如兔、小鼠和人类）中诱导的抗RBD单克隆抗体的识别特征是否保守。分析发现，源自不同物种的单克隆抗体可能具有相似的识别基序，这些基序可能来自不同的抗体基因片段或V-D-J重组过程中的N区添加。例如，人类单克隆抗体中存在一类具有CDRH3 YYDxxG基序的抗体，它们通过特定的氢键模式识别RBD的Class 1/4表位。类似的识别模式也在兔单克隆抗体M8b-C9中被发现，尽管其YY基序源自N区添加而非D基因片段。这些发现表明，免疫系统在不同物种中可能独立地发展出相似的识别策略来对抗SARS-2病毒。

6、体外选择实验揭示病毒功能逃逸

通过细胞培养选择实验研究兔单克隆抗体对病毒逃逸的敏感性。实验使用编码不同SARS-2和SARS-1刺突蛋白的rVSV，在不同兔单克隆抗体的存在下进行选择，以观察病毒逃逸变体的出现。结果显示，不同单克隆抗体导致病毒在RBD表位内或外的不同残基发生替换，这些替换与之前的结构分析和DMS结果一致。例如，M8b-A10导致SARS-2和SARS-1病毒在4类RBD表位内的残基发生替换，而M8b-B1致使病毒在表位内外的残基发生替换。这些实验揭示了病毒逃逸的潜在路径，并为理解单克隆抗体的中和机制和病毒适应性提供了重要信息。

总结

研究者使用Mosaic-8纳米颗粒对兔子进行免疫，并通过Beacon的多重结合检测法预筛选具有广泛识别能力的抗体。在仅筛选了14种单克隆抗体的情况下，研究者就发现了与Pemgarda表位重叠或相似的M8b-B8和M8b-C10，以及具有广泛交叉反应性的Class 4（M8b-A10）和Class 1/4（M8b-C9）单克隆抗体。这表明，尽管人类和动物之间的抗体基因片段库存在差异，但免疫系统可以利用不同的抗体基因片段来实现相似的抗原识别模式。Beacon多重检测方法的重要性在于其能够快速评估单克隆抗体对多种抗原的结合能力，从而高效筛选出具有广泛识别能力的抗体，这对于开发针对SARS-2及其变体的广谱中和抗体具有重要意义。