大鼠OVAlgE检测：试剂盒使用要点速览

一、实验原理

优品生物OVAlgE检测试剂盒基于酶联免疫吸附试验（ELISA），通过特异性抗原（卵清蛋白）与待测样本中IgE抗体的结合反应，利用酶标记系统放大信号，最终通过显色强度定量抗体水平。优品生物的试剂盒采用高纯度重组卵清蛋白包被微孔板，配套抗大鼠IgE酶标抗体及化学显色体系，兼具灵敏度高（通常可检测低至1-10 ng/mL）与特异性强的特点。

二、实验关键步骤及注意事项

1. 样本采集与预处理

样本类型：优先使用血清或血浆（需避免溶血），组织匀浆需经高盐缓冲液充分裂解并离心去除细胞碎片。

立即检测：若无法当日检测，样本应分装后置于-20℃冷冻保存（避免反复冻融），长期保存建议转移至-80℃。

稀释要求：根据试剂盒说明书调整样本稀释比例（如血清通常1:100-1:500稀释），避免高浓度样本导致钩状效应。

2. 试剂准备

试剂复溶：干粉试剂（如酶标抗体、显色液）需按说明书梯度复溶，轻摇避免泡沫，复溶后建议置于2-8℃短期保存。

标准品配置：使用前将梯度浓度标准品（如0-1000 ng/mL）依次稀释，混合均匀后分装至反应孔。

质量控制：每批次实验需设置阳性对照（已知高表达样本）、阴性对照（无抗体血清）及空白对照（不含样本和一抗）。

3. 加样与孵育

加样顺序：推荐“样本封闭剂一抗二抗显色”的顺序，避免交叉污染。加样时使用移液器垂直吸取，轻弹微孔底部混匀。

孵育条件：严格遵循说明书时间（如包被抗原37℃ 1h，酶标抗体4℃过夜），温度偏差可能导致信号异常。

洗涤要求：洗涤液需充分浸润孔底，每次洗涤后甩干或吸干残留液体，避免缓冲液残留干扰显色。

4. 显色与终止

显色时间：TMB显色液（常见底物）通常在37℃下反应10-15分钟，颜色由蓝转黄，超时可能导致背景增高。

终止反应：加入终止液（如2M H₂SO₄）后立即终止反应，避免颜色继续加深。

5. 结果判读

数据读取：以空白孔调零后，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（A值）。标准品绘制标准曲线时需确保R²>0.99。

阈值设定：通过阴性对照平均值的3倍标准差确定临界值，样本A值超过阈值判定为阳性。

三、常见问题与解决方案

无信号/信号弱

可能原因：样本中抗体含量过低、稀释倍数过高或试剂失效。

解决方案：增加样本量、降低稀释比例或更换试剂盒批次。

高背景/假阳性

可能原因：非特异性结合、洗涤不彻底或交叉反应。

解决方案：延长封闭时间（如使用5% BSA替代脱脂奶粉），增加洗涤次数（至少5次）。

标准曲线不线性

可能原因：标准品降解、加样误差或孵育条件不当。

解决方案：重新配制标准品，确保梯度严格等比稀释，检查实验操作一致性。

四、实验优化建议

抗原包被优化：若检测灵敏度不足，可尝试提高包被浓度（如从1μg/well增至2μg/well）。

封闭剂选择：部分样本（如高脂血清）建议改用酪蛋白封闭剂以提高特异性。

一抗稀释：通过预实验确定最佳稀释比例（通常1:1000-1:5000）。

五、试剂盒储存要点

未开封试剂：保存于2-8℃避光环境，有效期一般为12个月。

已开封试剂：酶标抗体与显色液建议开封后2周内用完，避免反复冻融。

通过严谨的实验设计与规范操作，结合优品生物试剂盒的高品质保障，可有效提高大鼠OVAlgE检测的准确性。实验过程中需定期验证试剂性能，并建立实验室内部质控体系以保障结果可靠性。