大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）检测：ELISA 试剂盒的科学指南

在科研的奇妙领域中，深入了解大鼠体内叶酸受体自身抗体（FRAA）的奥秘，对于探索相关生理机制和疾病研究至关重要。大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）试剂盒（ELISA）就像是一把精准的 “钥匙”，为我们打开了定量检测血清、血浆、细胞培养上清液等样本中 FRAA 浓度的大门。在使用这个神奇的试剂盒之前，让我们一起深入了解它的方方面面吧。

一、基本信息速览

这款试剂盒有 48T 和 96T 两种规格，检测范围在 25 - 800 ng/ml 之间。它具有高度的特异性，对于结构类似物不会产生交叉反应，灵敏度更是小于 1.0 ng/ml。在重复性方面表现出色，板内变异系数均小于 10%，板间变异系数均小于 15%。从物理性能上看，试剂盒的各液体组分应呈现澄清透明的状态，微孔板铝箔袋不能有破损漏气的情况。它需要在 2 - 8℃的环境下保存，有效期为 6 个月。本试剂盒仅用于科研用途，严禁用于临床诊断。如果在使用过程中遇到任何问题，您可以通过免费电话 400 - 8332 - 227、官方热线 0595 - 2284 - 5743、技术电话 15260335612 联系我们，或者访问公司网址 www.ruixinbio.com。联系时请提供产品货号和生产日期（可在盒签上找到），以便我们更高效地为您服务。二、实验原理揭秘

本试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）来实现对 FRAA 的检测。想象一下，预包被了大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）捕获抗原（固相抗原）的微孔酶标板，就像是一个精心搭建的 “舞台”。当我们把大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）校准品和待测样本加入这个 “舞台” 后，它们开始在这里 “活动”。接着，加入另一株 HRP 标记的抗大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）抗体（酶标抗体），经过一段时间的温育与充分洗涤，就像一场精心编排的 “舞蹈”，去除了未结合的组分。最终，在微孔板固相表面形成了固相抗原 - 抗体 - 酶标抗体的夹心复合物。

然后，我们加入底物 A 和 B，在 HRP 的催化下，底物开始发生奇妙的变化，产生蓝色产物。这时，再加入终止液，蓝色产物就会最终转化为黄色。我们通过酶标仪在 450nm 波长上测定吸光度（OD 值），这个吸光度（OD 值）与待测样品中大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）的浓度是正相关的关系。通过拟合校准品曲线，我们就能像解开谜题一样，计算出样本中大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）的浓度啦。三、试剂盒使用规则

用途限定：本试剂盒专为科研而生，绝不能用于临床诊断，这是我们使用它的首要原则。

有效期谨记：一定要在试剂盒标示的有效期内使用，过期的试剂盒就如同过期的食品，可能会失去原有的功效，所以过期产品切勿使用。

避免混用：不要将本试剂盒与其他厂家的试剂盒或组分混合使用，不同厂家的产品如同不同的拼图，混在一起可能会打乱整个检测过程，导致错误的结果。

样品稀释要求：请使用试剂盒配套的样品稀释液进行样品稀释，以确保检测的准确性。

高浓度样本处理：如果样本值高于最高标准品浓度值，别担心，将样本适当稀释后再重新测定即可。

排除干扰因素：待测样本中可能存在人抗鼠等异嗜抗体，它们就像 “捣乱分子”，会干扰检测结果。因此，在检测前务必排除这个因素。

结果不可比性：通过其他方法得到的检测结果与本试剂盒的测定结果不具有直接的可比性，所以我们要专注于本试剂盒的检测方法和结果分析。

四、技术操作小贴士

在使用试剂盒的过程中，还有一些实用的技术提示可以帮助我们获得更准确的结果：

防止气泡产生：混合蛋白溶液时要格外小心，尽量避免产生气泡，因为气泡可能会影响实验结果的准确性，就像平静的湖面被投入石子，会扰乱原本的秩序。

避免交叉污染：加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分采用悬臂加样的方式，这就像给每个实验对象都配备专属的 “工具”，防止交叉污染。

控制温育和洗涤：合适的温育时间和充分的洗涤步骤是保证实验结果准确的必要条件，温育时间要严格按照说明书操作，洗涤也要彻底，就像烹饪时要掌握好火候和清洗好厨具一样。

优化洗板操作：使用自动洗板机时，加入一个 30 秒浸泡的步骤，可以让洗板效果更上一层楼，提高检测精度。

判断底物状态：底物溶液正常应为无色液体，如果在保存过程中变为蓝色，这是一个危险信号，说明底物溶液已经失效，不能再使用了。

正确添加终止液：终止液的加样顺序要与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物会瞬间变为黄色，这是反应正常进行的标志。

保存剩余板条：实验中用剩的板条，要立即放回自封袋中密封，放在低温干燥的环境下保存，以备下次使用。

摇匀液体组分：所有液体组分在使用前都要充分摇匀，并且严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作，任何小的失误都可能影响实验结果。

五、所需仪器与用品

为了顺利完成实验，我们还需要准备以下仪器和用品：

酶标仪（450nm）：它就像一个精准的 “读数器”，能准确测量吸光度，是获取实验数据的关键工具。

精密移液器及一次性吸头：它们是加样的 “得力助手”，能精确控制加样量，并且避免交叉污染。

蒸馏水：用于稀释试剂，保证实验的纯净性。

洗瓶或者自动洗板机：负责清洗反应孔，去除残留杂质，确保实验环境的清洁。

37℃水浴锅或恒温箱：为实验提供适宜的温度环境，让反应在最佳条件下进行。

500ml 量筒：准确量取试剂体积，保证实验的准确性。

六、试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒需要在 2 - 8℃的环境中 “安睡”，过期的试剂盒坚决不能使用。下面来认识一下试剂盒的各个 “成员”：

校准品：0.3ml / 管，提供不同浓度的标准品，用于绘制标准曲线，是我们计算样本浓度的重要依据。开封后需在 2 - 8℃保存 14 天。

包被微孔板：有 96T 和 48T 两种规格，预包被固相抗原，为实验反应提供场所。开封后同样在 2 - 8℃保存 14 天。

HRP 标记抗体：10mL，是 HRP 标记的检测抗体，在实验中发挥关键的检测作用，开封后可在 2 - 8℃保存 180 天。

样本稀释液：6mL，用于稀释样本，确保检测的准确性，开封后 2 - 8℃保存 180 天。

底物液 A：6mL，主要成分是 0.01% 过氧化氢，与底物液 B 共同参与显色反应，开封后 2 - 8℃保存 180 天。

底物液 B：6mL，含有 0.1% TMB，与底物液 A 按比例混合后发挥作用，开封后 2 - 8℃保存 180 天。

终止液：6mL，2mol/L 稀硫酸，用于终止显色反应，开封后 2 - 8℃保存 180 天。

20× 浓缩洗涤液：25mL，含 0.05% Tween20，用于清洗反应孔，开封后 2 - 8℃保存 180 天。

说明书：1 份，它是实验的 “指南手册”，详细指导我们整个实验过程。

自封袋：1 个，用于保存未使用完的板条。

不干胶：2 片，可用于标记或密封等操作。

这里要注意，如果试剂盒的组份需要再次使用，一定要确保上一次使用之后没有被污染。酶标板单次未使用完，要记得密封好放到 2 - 8℃保存。七、生物安全注意事项

在实验过程中，生物安全至关重要：

遵守规范防污染：检测必须符合实验室管理规范，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

避免接触防腐剂：试剂盒的液体组分中含有 proclin - 300 防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，操作时要避免吸入烟雾，更不要与皮肤接触。

防范底物液刺激：底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，同样要避免吸入烟雾，操作时最好戴上防护手套。

做好个人防护：实验过程中要全程戴上防护手套，实验完成后彻底洗手，保护好自己的身体健康。

八、样品的采集与储存

样本类型和采集

不同的样本类型有各自独特的采集方法：

细胞培养上清：在 4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，将上清液保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。

血清：使用不含热原和内毒素的试管采集血液，操作过程中避免刺激细胞，在 4000rpm 条件下离心 20min，小心分离出血清，保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。

血浆：可选用肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 条件下离心 20 分钟取上清，血浆同样保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。

组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01 M,pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后剪碎组织。按照 1: 9 的重量体积比（可根据实验需要调整，并做好记录，推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂），将剪碎的组织与 PBS 加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为进一步裂解组织细胞，可对匀浆液进行超声破碎或反复冻融，最后将匀浆液在 5000×g 离心 5 - 10 分钟，取上清检测。

细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次，每 1×10⁶ 个细胞中加入 150 - 200μL PBS 重悬，通过反复冻融使细胞破碎（若含量很低可减少 PBS 的体积）。将提取液于 1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。

其他生物体液：1000×g 离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。

样本保存和稳定性

样本在 2 - 8℃条件下可储存 72h，在 - 20℃可储存 6 个月。如果样本收集后不能一次检测完毕，应按一次用量分装冻存，避免反复冻融。使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。九、试剂准备与操作程序试剂准备

充分复温：使用前，样本和试剂盒所有的组分都要至少复温 120min，确保充分复温到室温，让它们以最佳状态参与实验。

处理浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液可能会有结晶产生，这是正常现象，通过水浴加热使结晶完全溶解。然后将浓缩洗涤液与蒸馏水按 1:20 稀释，即 1 份的浓缩洗涤液添加 19 份的蒸馏水。

混合底物：底物液 A 和 B 在使用前，按 1:1 体积充分混合，并且混合后 15 分钟内使用，以保证其活性。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品建议做复孔，以提高实验的准确性。

配制工作液：按前面说明书描述的方法，精心配制好试剂盒各种组分的工作液。

取出板条：从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱，妥善保存。

设置反应孔：设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。

加入酶标抗体：除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL。

温育反应：用封板膜盖住反应板，在 37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 60min，让反应充分进行。

洗板操作：揭开封板膜，弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩去洗涤液，再在吸水纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，按洗板机操作程序进行洗板，并添加浸泡 30s 的程序，可提高检测精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

加入底物：将底物 A 和 B 按 1:1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反应板，在 37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 15min。

读取数据：所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪 450nm 波长上读取各孔吸光度（OD 值）。

十、结果计算与问题解答

结果计算

以标准品浓度做为横坐标（6 个标准品孔，加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点），对应的吸光度（OD 值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），创建标准曲线方程。通过样本的吸光度（OD 值），利用方程就能计算出样品的浓度值。

如果样品被稀释，通过上述方法测得的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

实验者需根据自己的实验建立标准曲线，提供的示意图仅供参考。

问题解答

在实验过程中，可能会遇到一些问题，以下是常见问题的可能原因及解决方案：

标准曲线差：可能是试剂盒平衡时间不够（应不低于 2 个小时的室温平衡）、吸取及洗涤不充分、移液不精确、混匀不充分和吸取试剂不足、重复利用吸头、容器和覆膜、加样不精确等原因导致。解决方法是确保充分的平衡时间、充分的吸取及洗涤、检查和校正移液器、充分混匀和吸取试剂、使用新的吸头和封板模等。

O.D 值低：可能是每孔加的试剂量不精确、温育时间不正确、温育温度不正确、酶标记物或底物失效、没有加入终止液、超出读数时间读数等原因。解决方法是校正移液器，精确加入试剂；保证充足的温育时间和准确的温育温度；检查酶标记物和底物的有效性；按照说明书操作加入终止液；在推荐的读数时间内读数。

样本值不正确：可能是样本储存方式不正确、样本收集和处理方法不正确、待测物质在样本中含量低等原因。解决方法是正确储存样本，使用新鲜样本进行实验；采取正确的样本收集和处理方法；使用新鲜样本，重复实验。

十一、重要说明

由于现有条件及科学技术水平的限制，我们尚不能对供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

不同批次的同一产品可能会有少许差别，网站电子版说明书仅作参考。

本试剂盒配套试剂必须配套使用，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明，才会得到最佳的检测结果。

用于制备试剂盒中抗体的免疫原通常为重组蛋白，但由于制备重组蛋白所选取的片段、表达系统、纯化方式等各有不同，所以我们无法保证该试剂盒可用于其他公司重组蛋白

写完

用于制备试剂盒中抗体的免疫原通常为重组蛋白，但由于制备重组蛋白所选取的片段、表达系统、纯化方式等各有不同，所以我们无法保证该试剂盒可用于其他公司重组蛋白的检测，通常我们也不建议使用试剂盒检测重组蛋白。

该试剂盒仅供研究使用，如将其用于临床诊断或任何其他用途，我公司将不对因此产生的问题负责，亦不承担任何法律责任。

本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。若不慎接触，应立即用大量清水冲洗，必要时寻求医疗帮助。

通过以上全面的介绍，相信您对大鼠叶酸受体自身抗体（FRAA）试剂盒（ELISA）已经有了深入的了解。在科研的道路上，每一个细节都可能影响到最终的结果，希望您能严格按照说明书操作，充分发挥该试剂盒的作用，为科学研究贡献更多有价值的数据和成果。愿您在科研探索中不断取得新的突破和发现！