利用小分子竞争剂和催化剂，设计动态水凝胶生物墨水

大家好！今天了解一项动态水凝胶生物墨水研究——《3D bioprinting of dynamic hydrogel bioinks enabled by small molecule modulators》发表于《Science Advances》。在生物打印领域，合适的生物墨水一直是关键。传统材料难以兼顾性能，而动态材料虽具潜力却面临打印性和稳定性的挑战。该研究涉及一种由小分子调节剂实现的动态水凝胶生物墨水，用于3D生物打印。这种生物墨水为生物打印领域带来了新的突破，有望在组织工程和疾病建模等方面发挥重要作用。让我们深入探究其奥秘。

*本文只做阅读笔记分享*

一、研究背景

（一）3D生物打印的潜力与局限

3D生物打印是一种新兴的增材制造技术，能够制造复杂的生物结构，模拟天然组织，为个性化医疗、组织再生和药物测试等领域带来了希望。然而，目前该领域受到合适生物墨水材料缺乏的限制。大多数用于3D细胞培养和生物打印的传统材料通过不可逆共价键交联，表现出弹性行为，而人体组织大多具有粘弹性和应力松弛特性。因此，需要开发能够更好模拟天然组织力学特性的生物墨水，以实现更有效的3D生物打印。  

（二）动态生物墨水的需求与挑战

动态材料能够通过细胞产生的力进行动态重塑，对调节细胞行为至关重要。虽然已有一些动态、粘弹性生物材料被开发用于3D细胞培养，但将其转化为生物墨水仍面临挑战。特别是动态共价交联的材料在打印过程中容易受到侵蚀和粘性流动的影响，难以同时满足可打印性和长期稳定性的要求。例如，之前尝试使用光诱导固化来稳定材料，但会改变水凝胶的粘弹性力学性能。

（三）本研究的目标

本研究旨在设计一种动态生物墨水系统，通过使用小分子调节剂来控制生物墨水的机械性能，以实现可打印性和稳定性的平衡，从而制造出能够模拟天然组织的3D生物打印组织模型。

二、动态生物墨水系统的设计

（一）材料选择与制备

为了制备粘弹性动态生物墨水，研究人员选择了腙交联方式，这种交联方式基于醛（ALD）和肼（HYD）官能团之间的可逆反应。他们使用透明质酸（HA）和弹性蛋白样蛋白（ELP）作为原料，对HA进行化学修饰，使其带上ALD或苯甲醛（BZA）官能团，对ELP带上HYD官能团，二者混合后形成的腙键可在生理条件下自发断裂和重建，从而使材料具有粘弹性和应力松弛特性。

（二）小分子调节剂的作用

1、小分子竞争剂

研究引入了一种甘氨酸基肼类似物作为小分子竞争剂，它能够与功能化HA上的醛基可逆反应，减少水凝胶中的交联数量，从而降低墨水的刚度，使其更易于挤出。例如，在实验中，随着竞争剂浓度的增加，HELP墨水的储能模量呈剂量依赖性降低（竞争剂浓度越高，储能模量越低）。而且，尽管竞争剂会增加凝胶化所需时间，但含有最高浓度竞争剂（20mM）的水凝胶仍能在30分钟内形成凝胶，这为打印前在打印墨盒中允许凝胶化的时间设定了下限。  

此外，竞争剂与网络的可逆结合使其在打印后能够扩散离开打印结构，进入水介质中，从而使墨水硬化。例如，在含有10mM竞争剂的HELP水凝胶实验中，初始时其剪切模量降低，但在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中放置24小时后，储能模量恢复到不含竞争剂的水凝胶水平。

2、催化剂

催化剂的作用是增加腙键交换速率，从而提高材料的剪切稀化能力，使其在机械力作用下更易挤出。在频率扫描实验中，研究发现改变催化剂浓度不会影响HELP水凝胶的刚度（不同催化剂浓度下的平台储能模量相近），但会增加凝胶的剪切稀化能力，即随着剪切速率增加，粘度下降更陡峭。  

（三）打印过程与稳定性控制

将小分子竞争剂和催化剂与HELP材料结合，能够使墨水在打印过程中顺利挤出。打印时，墨水被挤入由明胶微粒组成的支撑浴中，支撑浴在墨水沉积过程中起到物理限制作用，消除了墨水在空气中自支撑的要求。打印后，小分子竞争剂和催化剂通过扩散离开打印结构进入支撑浴，使墨水硬化并稳定打印结构。例如，在打印含有1wt%HA-ALD、1wt%ELP-HYD、10mM催化剂和20mM竞争剂的HELP材料时，能够成功打印出复杂结构，且在支撑浴中放置1.5小时后，结构稳定，可从支撑浴中取出进行后续培养。

三、优化HELP墨水材料

（一）初始配方的问题

最初的HELP墨水配方（1wt%HA-ALD/1wt%ELP-HYD）虽然可打印，但打印结构在长期培养中稳定性较差。在实验中，将其打印成标准晶格结构并置于明胶微粒支撑浴中，结构在从支撑浴中取出后立即保持完整性，但在37°C的PBS中培养1天内就会出现明显的肿胀和侵蚀，14天后打印结构几乎完全消失。进一步测量凝胶侵蚀动力学发现，1天后约27%的打印结构被侵蚀，14天后侵蚀率达到47%。  

（二）改进策略与效果

为提高稳定性，研究人员合成了HA-BZA，其具有较慢的键交换速率。使用HA-BZA制备的墨水（1wt%HA-BZA/1wt%ELP-HYD）打印出的晶格在培养2周内形状保真度高，侵蚀率低于3%。然而，HA-BZA墨水的可打印性较差，即使使用更高浓度的竞争剂和催化剂（高达80mM竞争剂和50mM催化剂），打印出的结构仍不理想。为平衡可打印性和稳定性，将HA-ALD和HA-BZA按50:50比例混合，添加与ALD-onlyHELP墨水相似量的竞争剂（20mM）和催化剂（10mM）后，得到的墨水在保持良好可打印性的同时，结构稳定性显著提高，侵蚀率与BZA-only墨水相似，远低于ALD-only墨水。

（三）墨水性能与可打印性的关系

研究人员测量了不同HA材料（ALD-only、BZA-only、50:50ALD:BZA）的HELP凝胶在相同聚合物重量百分比（1wt%）下的储能模量，发现三者刚度无显著差异，表明网络形成程度相似。但在增加竞争剂浓度时，BZA-only墨水的储能模量降低幅度远小于ALD-only和50:50ALD:BZA墨水，这可能是由于BZA的解离动力学较慢，影响了竞争剂与水凝胶网络的有效交换，在较短时间尺度（<1小时）内无法形成平衡网络。

此外，测量含或不含20mM竞争剂的HELP材料的屈服应力发现，屈服应力与墨水在打印过程中的可挤出性相关。在没有竞争剂时，BZA-only墨水的屈服应力显著高于其他两种材料，添加竞争剂后，三种材料的屈服应力均降低，但BZA-only墨水的屈服应力仍相对较高。ALD-only和50:50ALD:BZA墨水的屈服应力相似，与它们在凝胶相支撑浴中可打印出一致且完整晶格结构的观察结果相符。这些结果表明，刚度和屈服应力均可作为生物墨水可打印性的预测指标，较高的刚度和屈服应力会降低生物墨水的可打印性。  

四、利用动态材料模拟癌症微环境

（一）细胞在不同交联材料中的行为

1、材料制备与特性匹配

研究合成了由静态共价键交联的HELP-static和动态共价键交联的HELP-dynamic，通过控制聚合物的功能化程度，使二者在相同聚合物重量百分比（1%HA和1%ELP）下具有相同的刚度（二者储能模量相同）。然而，它们的交联化学不同导致粘弹性行为有差异，HELP-dynamic具有应力松弛特性，而HELP-static不具备（HELP-dynamic的应力随时间松弛，HELP-static则不松弛）。

2、细胞培养与形态观察

将乳腺癌前细胞（MCF10AT）封装在这两种材料中培养，未处理时，细胞在两种材料中均形成非侵入性球体，这与之前在3DMatrigel和胶原蛋白培养中的报道一致（如图4C顶部所示）。当用转化生长因子-β（TGF-β）处理后，在HELP-dynamic中，细胞形成具有大突起的侵入性结构；而在HELP-static中，细胞形成的仍是较小的、大多为非侵入性的细胞簇。  

通过对细胞簇圆形度的量化分析发现，在没有TGF-β时，两种材料中的细胞形成的球体圆形度高；添加TGF-β后，在HELP-dynamic中细胞簇圆形度显著降低（中位数为0.64），而在HELP-static中圆形度无显著变化（中位数分别为0.84和0.92）。

基因表达分析进一步表明，在HELP-dynamic中培养的细胞经TGF-β处理后，E-cadherin表达降低，vimentin表达升高，表明发生了上皮-间质转化（EMT），而在HELP-static中这些变化不显著。这些结果说明基质粘弹性对细胞侵入行为有重要影响，动态共价交联的材料能够更好地模拟癌症侵袭等动态过程。  

（二）3D生物打印构建肿瘤微环境模型

1、细胞活力与增殖

将优化后的HELP材料与细胞混合制成生物墨水进行3D生物打印，细胞的存在不影响HELP墨水的凝胶化动力学和最终模量。

打印后的MCF10AT细胞活力高，通过Live/Dead细胞毒性测定发现，打印前后细胞活力相似，培养3天后仍保持较高活力。  

培养6天后，MCF10AT细胞能够增殖并形成分布良好的非侵入性球体，与铸型水凝胶培养中的行为相似。

2、空间图案化对细胞行为的影响

2.1 整合素结合的作用

通过3D生物打印实现了在同一基质中不同生化特征和细胞类型的空间图案化。研究人员打印了含细胞粘附配体（RGD）和不含细胞粘附配体（RDG）的交替区域的HELP材料，MCF10AT细胞和荧光微球分别悬浮在这两种生物墨水中，然后使用两个喷嘴并排打印。两种材料形成一个具有明显边界的单一凝聚结构，通过成像两种墨水中的荧光微球可确定边界。培养6天后，用TGF-β处理，发现RGD区域中的细胞形成侵入性结构，其圆形度（中位数为0.34）显著低于RDG区域中的细胞。这表明整合素结合有助于TGF-β诱导的细胞侵入，且旁分泌信号不足以刺激细胞侵入，与当前乳腺癌侵袭模型中整合素与基质微环境相互作用在癌症进展中起主导作用的观点一致。  

2.2 多细胞类型打印

将癌症相关成纤维细胞（CAFs）和MCF10AT细胞分别制成生物墨水，使用两个喷嘴将两种生物墨水打印成单一结构。两种细胞形成接触的重叠区域，以及各自细胞类型的空间限制区域，结构完整性在培养6天内得以维持。这表明单一配方的HELP材料可支持多种不同细胞类型的培养，为未来研究肿瘤与基质细胞间的动态相互作用提供了模型。

五、总结与展望

本研究开发的动态、粘弹性生物墨水材料通过小分子调节剂实现了对材料性能的精准控制，成功解决了动态材料在3D生物打印中可打印性和长期稳定性难以平衡的问题。利用该生物墨水模拟乳腺癌侵袭过程的实验表明，基质粘弹性和整合素参与对生长因子诱导的细胞侵袭至关重要。这种生物墨水不仅适用于特定的HELP材料，还可推广到其他聚合物系统，为生物打印领域提供了一种通用的策略。未来，该技术有望在构建更复杂的组织工程结构和体外疾病模型方面发挥更大的作用，为疾病研究、药物筛选等提供更有效的工具。

六、一起来做做题吧

参考文献：

Sarah M. Hull et al. 3D bioprinting of dynamic hydrogel bioinks enabled by small molecule modulators. Sci. Adv.9, eade7880(2023).