全能的HTRF：测量新鲜血液样本中细胞因子的释放

操作WB检测LC3条带总是变幻无常？是时候摆脱这个烦恼了！

自噬是一种天然的、保守的细胞降解机制，参与多种疾病过程，包括癌症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、衰老、细胞死亡、心脏病和感染，并帮助细胞清除受损的蛋白质、细胞器、病原体或聚集体，并被认为是一种程序性细胞死亡机制，自噬调节细胞死亡的潜在能力使其成为癌症的治疗靶点 [1, 2]。

LC3家族包括LC3A、LC3B和LC3C三个亚型。LC3B是研究最多的一个亚型，也是公认的自噬关键指标。LC3B的前体形式为proLC3B，被ATG4蛋白裂解后生成LC3B-I（约16kDa），LC3B-I被ATG7和ATG3修饰和加工后，再与磷脂酰乙醇胺(PE)结合，生成LC3B-II（约14kDa）， LC3B-II是自噬体标记的关键蛋白之一。

LC3B-II形成过程（From Agrotis et al., 2019）

瑞孚迪（Revvity） HTRF LC3B-II检测试剂盒，能够特异性检测LC3B-II而不识别LC3B-I。目前，Western Blot是常用的LC3B检测方法，但是已有的WB抗体无法区分LC3B-I和LC3B-II，均相免洗的HTRF LC3B-II检测试剂盒，在简化实验流程的同时，更进一步提升了LC3B-II检测的灵敏度和特异性。

特异性检测LC3B-II的HTRF模型

操作步骤-两板法检测流程

操作步骤-一板法检测流程

验证数据

U-87MG cells用自噬抑制剂HCQ （羟化氯喹）处理4小时，弃培养基并裂解，分别取16ul裂解物用于HTRF 及Western Blot平行检测。结果如下图所示，HTRF LC3B-II Detection Kit和Western Blot结果具有可比性且高度相关。

相关性验证

同时，近单倍体细胞HAP1 KO实验结果证实，HTRF LC3B-II Detection Kit对LC3B-II的检测具有高度特异性和选择性。

特异性验证

不同细胞密度的U-87 MG cells用mTOR 抑制剂AZD2014 (Vistusertib)处理， HTRF 及Western Blot平行对比结果显示，HTRF LC3B-II Detection Kit的检测灵敏度是Western Blot检测方法的2倍。

灵敏度验证

HTRF及Alpha试剂：

参考文献

1. Mathew R, Karantza-Wadsworth V, White E. Role of autophagy in cancer. Nat Rev Cancer. 2007;7(12):961–7.

2. White E, DiPaola RS. The double-edged sword of autophagy modulation in cancer. Clin Cancer Res. 2009;15(17):5308–16.