丙泊酚的神奇力量：修复癫痫突变体HCN1通道的分子机制揭秘

超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在大脑和心脏的节律性放电中起关键作用。HCN通道的功能失调与多种神经系统疾病和心律失常密切相关，尤其是与癫痫相关的基因突变引起了广泛关注[1][2]。丙泊酚（propofol），一种已知的全身麻醉剂，通过结合HCN1通道的特定位点抑制其电压依赖性门控。来自威尔康奈尔医学院的Crina M. Nimigean团队与合作者近日在Nature杂志中发表文章《Propofol rescues voltage-dependent gating of HCN1 channel epilepsy mutants》，采用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）和电生理学技术，深入解析了丙泊酚在分子水平上恢复HCN1通道癫痫相关突变体正常功能的机制。

本文主要研究以下科学问题：

1.丙泊酚对HCN1通道的抑制机制：丙泊酚通过什么方式与HCN1通道结合并抑制其活性？

2.癫痫突变体的恢复机制：丙泊酚如何修复因基因突变导致的HCN1通道功能障碍？

3.电压传感器与孔道之间的耦合机制：在HCN通道中，电压传感器的运动如何传递到孔道实现通道的开闭？丙泊酚又是如何影响这一过程的？

图1：丙泊酚-HCN1复合物的结构解析

通过使用冷冻电镜，作者成功解析了丙泊酚结合后的HCN1通道结构。结果显示，丙泊酚结合在S5和S6跨膜螺旋之间的一个凹槽中，即位点1，该结合位点在通道关闭状态时存在，而在通道打开状态时消失。这部分结果表明，丙泊酚通过占据S5和S6之间的结合位点，阻止了通道的开关转换，从而实现对HCN1通道的抑制。同时作者也发现了另一个结合位点2，但是通过分子动力学模拟等分析认为，该位点并不发挥抑制HCN的作用，在主图中也没有体现。

图2：结合位点1的状态依赖性及突变对药物敏感性的影响

之后作者又探讨了丙泊酚结合位点1在不同通道状态下的变化，并研究了关键残基突变对药物敏感性的影响，包括T384和M305。结果表明，结合位点1在通道关闭状态下存在，而在通道打开状态下消失。突变这些关键残基会降低丙泊酚的药效，表现在丙泊酚可以左移HCN的激活曲线，但在T384F和M305E突变体中，这种左移效应减小。

图3：丙泊酚恢复致病性HCN1突变体的功能

那么由于HCN的突变会导致癫痫等疾病，作者想知道丙泊酚如何修复HCN1癫痫相关突变体（如M305L和D401H）的功能呢。先前的研究表明M305L突变后使得HCN1成为了一种“leaky”通道，失去了电压依赖性的特点，但加入丙泊酚之后恢复了其电压依赖的门控，出现了去极化诱导的通道关闭现象。这说明丙泊酚结合HCN1的位点不仅影响了通道的开关转换，也影响了电压依赖的通道关闭过程。

图4：丙泊酚对HCN1通道电压传感器运动的影响

之后作者利用电压钳荧光测量（VCF）技术，即在蛙卵进行双电极电压钳记录的同时，通过荧光记录电压感受器的移动。他们研究了丙泊酚对HCN1通道电压传感器运动的影响。作者的研究对象为spHCN（海胆HCN通道）的M375L突变，和HCN1的M305L突变类似，该突变也不表现电压依赖的通道关闭，也能被丙泊酚恢复，但VCF结果表明电压传感器domain的动力学没有明显变化。上述结果说明丙泊酚在降低电流的同时，对电压传感器的运动没有显著影响。

图5：电压传感器运动与通道关闭的解耦

之后作者利用电压钳荧光测量（VCF）技术，研究了丙泊酚对WT  spHCN通道的影响。结果表明，丙泊酚在抑制spHCN电流的同时，对电压传感器的运动没有显著影响。

基于上述实验的结果，作者给出了丙泊酚抑制WT及癫痫相关突变的HCN通道的可能机制：WT情况下，HCN1通道关闭状态下，S4上移，通过R297-D401和M305-F389等相互作用稳定。在超极化响应中，S4的个体向下移动会破坏S4和S5之间的相互作用，在S4和S5之间打开了一个裂缝，允许S5向外摆动，并使S6旋转，打开孔道。丙泊酚的结合稳定了关闭状态并增强了电压传感器到门控的耦合；M305L突变情况下，由于缺少M305-F389相互作用，关闭状态不稳定。丙泊酚的结合稳定了关闭状态并增强了电压传感器到门控的耦合。S4上移的关闭状态通过R297-D401和丙泊酚-M305L-F389相互作用稳定。

结论

本文通过冷冻电镜和电生理学技术，深入揭示了丙泊酚对HCN1通道的作用机制。丙泊酚通过结合S5和S6之间的特定位点，抑制HCN1通道的活性，并能恢复癫痫相关突变体的电压依赖性门控。这些发现为开发针对HCN通道相关疾病的新药提供了重要的理论基础。这项工作不仅是解析了药物和离子通道复合体的结构，也为药物是如何影响离子通道门控机制提供了可能的模型，解决了重要的神经药理学问题。同时结合临床，深入分析了致病突变的分子机制和药物干预机制，具有重要的临床价值。

参考文献

[1] Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets.Nat Rev Drug Discov10, 903–914 (2011).

[2] Nava, C., Dalle, C., Rastetter, A.et al.De novomutations inHCN1cause early infantile epileptic encephalopathy.Nat Genet46, 640–645 (2014)

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