【文献解读】Cas12a结构和功能新机制

CRISPR-Cas12a的特殊性质使其成为生物技术和治疗应用中理想的RNA引导核酸内切酶。已有的研究表明，Cas12a通过识别并结合原间隔短回文序列邻近基序（PAM）来启动R-loop的形成，并以此识别目标DNA。R-loop的形成促发了Cas12a RuvC结构域的激活，从而对目标DNA进行切割。尽管如此，关于Cas12a R-loop形成的具体步骤和结构变化、RuvC盖子的重置机制及Cas12a的特异性维持机制尚未得到合理解释，也并未有研究详细描述Cas12a结构域的灵活性。对此，科学家们期望进行更深入的研究以获得更多的结构见解，从而推动基于CRISPR-Cas12a的基因编辑技术和生物技术的发展。最近，德克萨斯大学奥斯汀分校的研究员在《Molecular Cell》上发表研究成果“Cas12a domain flexibility guides R-loop formationand forces RuvC resetting”，该研究通过cryo-EM技术进一步探索Cas12a的结构和功能，所获得的结构上的见解合理解释了Cas12a的DNA靶向行为和更高的特异性。

一、Cas12a在切割过程中的结构

为了捕获R-loop形成过程中 WT Cas12a 的各种中间体，研究人员将WT Cas12a 和与crRNA具有不同互补序列长度的靶标DNA 底物一起孵育并获取冷冻电镜图。从中，研究人员获得了六个不同的R-loop中间结构，标称分辨率范围为3.3至3.7 Å。

冷冻电镜结果中WT Cas12a的这些结构描述了R-loop的瞬态中间状态，同时也揭示几个广泛观察到的结果。首先，分解的R-loop碱基对的数量并不总是等于目标互补的程度，如8 bp 目标数据集产生了两个结构5- and 8-bp R-loops以及12 bp的目标数据集产生了一个新的中间产物10 bp R-loop，这暗示了R-loop形成过程中能量障碍的相对位置。其次，中间R-loop传播过程中REC2未被解析。最后，在R-loop传播过程中，远端DNA从Cas12a的前部向后部迁移，并沿着RuvC结构域将非靶标链（Non-Target Strand, NTS）连接起来。

图1 冷冻电镜捕获的Cas12a R-环中间体

二、Cas12a使用一个5 bp的R-loop种子区进行靶标识别活动

与其他RNA引导的效应物一样，Cas12a依赖于R-loop内的种子区来促进有效的靶标识别和区分错配序列。在该研究中，接触5 bp种子区的Cas12a的第一个结构显示，置位NTS的前三个核苷酸被PAM相互作用（PI）结构域捕获，REC1结构域向外移动以适应A型异源双链体的形成。大多数接触集中在 R-loop的前几个碱基对内，由WED (Wedge)和PI结构域形成。REC1结构域很少与种子末端的R-loop产生非特异性稳定接触(K51, N175, R176)。TS和NTS在位于RuvC结构域和REC1螺旋-环-螺旋之间的第6个碱基对上重新杂交，引导远端DNA退出复合物。R-loop-DNA 连接处的 DNA 位于 RuvC 结构域中一个笨重的环上K1054 突入 DNA 的小沟 。这些结果使得研究员们确定了具有相同 5-bp R-loop和未解析的 REC1 结构域的结构类别。

为了探究RuvC环在早期R-loop结构中的作用，研究员们构建并纯化了一个环缺失（LD）突变体，并测量了其对匹配和错配靶标裂解的影响。轻微降低的种子错配底物裂解率结果表明环有助于提高5-bp中间体在WT酶中PAM结合状态下的稳定性。LD突变体观察到的特异性增加可能是由于破坏早期R-loop中间体的稳定性并增加两种 DNA 底物的 R-loop崩溃率，从而导致错配存在的可测量减少。这些结果支持了在R-loop形成过程中，大环对种子稳定性具有重要作用。

图2 Cas12a 使用 5 bp 种子快速检查 DNA 互补性

三、早期和中期R环中间体的快速解离动力学促进了高效的靶标搜索

为了在功能上测量短 R-loop物质的稳定性，研究人员测试了它们竞争性抑制Cas12a靶向匹配靶DNA的能力。研究结果发现，16 bp 的竞争性靶标显示出依赖于预孵育时间的抑制作用，报告称该中间 R-loop可以稳定结合，但可能保持在 R-loop的易逆转区域内。20 bp 竞争者有效抑制 PT DNA 的所有切割，并证明 Cas12a 在 30 秒内稳定地与匹配的靶标结合，几乎没有解离。这种快速的R-loop中间体解离可能是一种机制，可以确保Cas12a不会在错误的DNA序列上被隔离，并且能够有效地搜索正确的靶标。这些竞争反应的快速解离动力学证明了研究人员们在冷冻电子显微镜数据集中观察到的早期和中期中间体代表了可逆 R-loop形成过程中的瞬态结构。

四、REC2 灵活性可适应 R-loop扩展，但会延迟接触

REC2结构域构象灵活性是R-loop中间结构中观察到的最引人注目的一系列变化之一。研究人员所得到的R-loop中间结构表明，REC2结构域在R-loop形成过程中具有显著的灵活性，这种灵活性允许R-loop延伸，但在形成过程中延迟了与Cas12a蛋白的接触。这揭示了在R-loop形成初期，Cas12a蛋白并不稳定中间体，从而允许R-loop的可逆性和对错误DNA序列的快速解离。

此外，研究人员通过cryo-EM观察到在中间R-loop形成过程中，REC2结构域和桥接螺旋（BH）域的动态变化，这些变化与R-loop的延伸和活性位点的暴露有关。在16-bp R-loop结构中，REC2开始以正确的方向与R-loop对接，但由于缺乏足够的稳定接触，它在结构中的占据率较低。随着R-loop的延伸，其形状发生变化，特别是在R-loop的远端部分，这种形状的变化影响了REC2结构域的对接和BH域的稳定性。

通过这些结果，研究人员判断REC2结构域的灵活性在Cas12a的DNA靶向和核酸酶激活中起着关键作用，它允许R-loop的动态形成和延伸，同时通过延迟接触形成来提高Cas12a对DNA靶向的特异性。

图3 中间 R-loop传播的特点是 REC2 灵活性、延迟 R 环路接触和 RuvC 激活

五、REC2对接后期促进催化作用

已有报道指出Cas12a 需要至少15 bp的 R-loop才能激活 RuvC 核酸酶的裂解，该研究中R-loop提供的结构框架正好解释最小长度R-loop如何导致核酸酶激活。

随着 R-loop的形成，RuvC 活性位点被 RuvC 盖子阻塞，直至形成15 bp R-loop结构。BH的构象重排使得与新形成的RuvC盖子α螺旋接触，暴露了活性部位。对此，研究人员提出一个机理模型，即具有足够长度以允许半稳定 REC2 对接的 R-loop将通过 BH 触点实现 RuvC 激活，但由于 REC2 和 BH 的灵活性导致效率降低。

为了支持这个模型，研究人员利用Cas12a对形成16或20 bp r -环的DNA底物进行NTS切割测试。结果显示，与20 bp R-loop相比，16 bp目标的NTS切割速率降低了5倍。此外，为了进一步测试REC2对接通过锚定BH在RuvC激活中的作用，研究人员构建了一个去除了REC2结构域(ΔREC2)的突变体进行研究。结果表明，与WT Cas12a相比，20 bp靶点NTS的切割率降低了65倍，16 bp靶点NTS的切割率降低了83倍。这些数据表明了 REC2 对接能感测 R-loop长度并通过 BH 将信号传达给 RuvC 域，从而促进激活方面的作用。

六、非靶标链准备在活性位点进行切割

通过冷冻电镜（cryo-EM）技术，研究人员们也捕捉了Cas12a与20 bp R-loop结合的完整结构，以解析在活性位点中即将被切割的非靶标链的状态。研究结果表明，在R-loop形成和延伸的最后阶段，NTS被移动到RuvC核酸酶结构域，正确地定位在活性位点中，准备进行切割。NTS在RuvC活性位点中被一系列正电荷残基网络所稳定，这些残基包括R912, K949, K1072, R1127, R1172, R1226, N1295。通过突变分析，研究员发现RuvC盖子α螺旋在稳定NTS起了至关重要的作用，特别是F999和R1003残基与NTS的相互作用。

为了更好地理解RuvC盖子在NTS切割初期的动态和作用，研究人员进行了分子动力学（MD）模拟，使用自适应偏差分子动力学（ABMD）方法来研究盖子从无结构环到α-螺旋的转变。通过观察结构变化的，他们发现NTS切割后，REC2结构域变得高度动态，Nuc域变得灵活，RuvC盖子返回到一个未结构化的环状结构，封闭了活性位点。目标链（TS）开始向活性位点移动，REC2和Nuc域的移动帮助TS进入活性位点，并且RuvC盖子的α螺旋在TS切割中也发挥了作用。

图4 RuvC介导的Cas12a切割DNA的结构

七、 Cas12a切割靶标链之前发生剧烈的构象变化并重置活性位点

为了了解目标链（Target Strand, TS）在Cas12a的RuvC活性位点中被切割前的显著构象变化，以及这些变化如何导致活性位点的重置，研究人员做了进一步的研究。首先，他们将Cas12a与在潜在的TS切割位点修饰磷酸硫酯（phosphorothioate, ps）键的20-bp目标DNA进行孵育结合。通过多轮三维变异性分析，研究人员捕捉到了Cas12a在RuvC介导的TS切割过程中的显著域灵活性，并在活性位点中捕获了TS。他们发现，在NTS（Non-Target Strand）切割后，REC2结构域变得高度动态，可以从R-loop上脱离并重新定位。Nuc结构域在TS接近活性位点时也表现出灵活性，并且与REC2结构域一起移动，以帮助TS进入活性位点。RuvC盖子在TS切割前后发生了显著的构象变化。在TS接近活性位点的过程中，REC2和Nuc结构域的移动帮助TS进入并正确定位在RuvC活性位点中。

此外，研究人员还测试了F999A和R1003A突变体的TS切割效率，发现这些突变显著降低了TS切割的效率，特别是对于16-bp目标，表明RuvC盖子中的苯丙氨酸（F999）对于稳定TS在活性位点中至关重要。研究结果表明，RuvC活性位点在NTS切割后需要重置，以准备下一次的TS切割，这种重置涉及到REC2和Nuc结构域的协调运动，以及RuvC盖子的构象变化。

图5 Cas12a R环形成和DNA切割的结构模型

综上所述，研究人员通过使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）和其他生化方法，对Cas12a蛋白在R-loop形成和DNA切割过程中的结构变化进行了深入分析，提供了Cas12a在CRISPR-Cas系统中进行基因编辑时的详细分子机制，特别是其如何通过结构域的灵活性和构象变化来实现高特异性的DNA靶向和切割，并为进一步的基于CRISPR-Cas12a的工程改造和应用提供了可能的方向。