动物行为与光电专题丨光遗传学-前脉冲抑制实验（PPI实验）

光遗传学刺激调控策略使用有线光遗传学结合行为学，特异性地激活两脑区之间的投射，可以直观反映神经环路与行为功能的因果联系。激发光源均为方波脉冲，并通过延长线，将473nm的激发光源与跳线相连，又通过陶瓷套管将跳线与之前埋置的光纤连接，通过调整激发光源的总激发时长、单次激发波长、频率、功率等参数，进行不同的光遗传学控制。

通过脑立体定位注射携带光敏基因的病毒,并埋置光纤构建光遗传学刺激调控模型以特异性激活单一神经环路。进行前脉冲抑制实验检测“光刺激-行为学功能”改变。光纤埋置坐标：腹侧下托（vSub），NAC Shell，脑立体定位手术构建光遗传模型。将大鼠随机分为对照组和实验组，分别注射AAV-GFP和AAV-ChR2-GFP。手术完成至行为学实验前的一段时间内，大鼠每日禁进食不宜过多，待确定完全恢复健康后，方可正常进食。同时，参与行为学实验的人员在此期间内每日上下午各选取一段时间抚摸大鼠，持续5min左右。主要是为了使大鼠与实验人员亲近，熟悉实验人员气味，防止实验过程中因大鼠挣扎而带来的实验误差。与之相同，大鼠需提前熟悉实验场地，避免因第一次进入而产生好奇，而影响测试结果。

前脉冲抑制实验

该装置由一台配备Windows操作系统的计算机和四个实验箱组成。每个实验箱都能有效隔离外界噪音，其内部都有一个透明的圆柱形外壳，顶部有一个间隙，由水平安装在可移动平台上的有机玻璃制成，可移动平台位于实验箱底部。安装在每个实验箱内的圆柱体容器正上方的扬声器产生65dB的连续背景噪音和各种不同强度的声音刺激。前脉冲的强度在背景噪音的基础上，依次增加4dB，直至达到85dB，而能引起大鼠ASR的脉冲强度固定为120dB。大鼠受到惊吓后的全身反应会引起圆柱体玻璃管的振动，通过与可移动平台相连的压电单元将压强信号转换成数字信号，这些信号输入计算机后经计算变为可视的数字信号。输出的平均振幅（任意单位）用于表示在对应脉冲强度下的ASR幅度。实验前3天，将受试大鼠每天上午9:00-10:00间放入圆柱体玻璃管内，持续5min，不给予噪音，且无其他干扰，以防止测试时因首次接触测试仪器，而在玻璃管内无规则碰撞，导致输出信号不稳。而正式实验前，需用可发出恒定噪音的马达调节实验箱平均振幅的基线，保持基线水平为150±10。然后将大鼠放置于圆柱体玻璃管内，紧闭测试箱后即可开始测试。各种强度的脉冲将按照设置好的程序依次出现，整个实验过程约持续40min。在此期间，实验箱所在房间无人员进出，保持外界环境的安静。实验结束后，实验人员用75%乙醇溶液清洁玻璃管及测试箱，并重新调节基线，再进行下一轮测试。在整个测试过程中保持65dB的背景噪音。

测试程序

具体如下：2min的适应期，6次惊跳脉冲（120dB，40ms/次），144次混合类型脉冲，6次惊跳脉冲（120dB，40ms/次），共计156个测试脉冲。混合类型脉冲包括背景噪音（65dB，80ms/次），5种单独前脉冲（20ms/次），5种单独前脉冲+惊跳脉冲（140ms/次，即在5个前脉冲刺激后，间隔80ms，给予120dB脉冲），惊跳脉冲（120dB，40ms/次），将144次脉冲分为12组，每组12个测试各随机出现1次。5种前脉冲强度在背景噪音基础上依次为+4（69）dB、+8（73）dB、+12（77）dB、+16（81）dB和+20（85）dB。脉冲间隔随机设定，在10-20s（平均15s）之间。ASR的幅度以前6次和中间6次120dB脉冲的平均振幅表示。%PPI的测量采用中间12组的12个测试进行计算。每个强度的前脉冲诱导的%PPI计算为[100-(100×前脉冲的惊吓幅度)/(120dB惊跳脉冲的惊吓幅度)]。作为多种神经精神疾病的相关临床表现，感觉运动门控功能的障碍在PPI实验中表现为ASR幅度的增加和%PPI的下降。值得注意的是，仅有ASR幅度的升高无法代表PPI行使的信息过滤功能的破坏，而%PPI的降低才能真正说明对冗余信息的内在响应过载，即感觉运动门控受损，因此本实验选取这两个指标评价感觉运动门控功能。

光遗传学-前脉冲抑制实验

本实验连续进行两天，在实验前3天安装好光纤并使之与激发光源相连，在实验箱玻璃管内熟悉环境。与正式实验时不同，熟悉环境时使用的跳线长度较大，且为硬质光纤不易折断，而正式实验时，跳线长度更换为50cm，并通过玻璃管上方空隙与光纤旋转接头连接，其目的在于保证实验的准确性前提下尽量减少光纤的损耗。

检测特定神经环路的兴奋性增强是否会影响PPI，光源照射的节点选在“5种单独前脉冲+惊跳脉冲”阶段，在5种单独前脉冲的前、中、后三点分别进行刺激。但在实际测试过程中，前脉冲仅维持20ms，而前脉冲与惊跳脉冲间仅间隔80ms，因此，只能将光照节点设置于5种单独前脉冲之前。每个测试间隔虽然为随机长短的时间，但其排列顺序不变，因此能计算出“5种单独前脉冲+惊跳脉冲”在程序中的时间节点，通过计算，将473nm激发光照射设定在5种单独前脉冲开始前2s内。通过将PPI测试系统的“Output”接口与激发光源的“Trigger”接口相连，可以实现在开始PPI程序的同时开始激发光源程序。该组合程序经过多次实验，误差极小。第一天实验时，大鼠安装好光纤设备，将其放入实验箱玻璃管内，调整激发光源功率为0mW，使大鼠在整个测试期间无光源照射。第二天实验时，大鼠安装好光纤设备，将其放入实验箱玻璃管内，调整总激发时长为2s，单次激发波长为50ms，频率为10HZ，功率为22mW。根据上述组合程序设置原则，除“5种单独前脉冲+惊跳脉冲”测试外，其余测试阶段功率均为0mW。

注意事项

在测试期间，由于光纤处于密闭实验箱内，所以需要实验人员不定时透过实验箱的观察孔观察光纤是否能正常给光，如果无法正常出光，立刻停止实验，查找原因。同时，观察期间实验人员应保持绝对安静。