通过976个脑胶质瘤样本分析PD-L1在转录中表达水平 的分子和临床意义

通过976个脑胶质瘤样本分析PD-L1在转录中表达水平

的分子和临床意义

摘要

背景：PD-L1作为一系列恶性肿瘤和一些原发性免疫疾病的免疫检查位点已得到广泛报道。在胶质瘤中，PD-L1的作用仍不清楚。我们的目标是研究其在转录水平上的意义以及与临床实践的关系。

方法和受试者：总共有976个胶质瘤样本的转录组数据纳入到我们的研究中，其中包括来自中国胶质瘤基因组谱（CGGA项目）的301个微阵列数据和来自TCGA项目的675个RNAseq数据。临床和IDH突变数据也可用。R语言作为统计分析和图形工作的主要工具。

结果:研究表明PD-L1的表达与胶质瘤的WHO分级呈正相关。根据TCGA转录分类方案，PD-L1似乎在间质亚型方面表达的更多，同时PD-L1可能成为胶质瘤母细胞中间质亚型的潜在标志物。皮尔森相关检验表明PD-L1与CGGA数据库中的PD1、PD-L2和CD80表现出较强的相关性。随后，基于与PD-L1显著相关基因的基因本体分析表明PD-L1似乎与T细胞的活化密切相关。为了进一步研究PD-L1的表达与免疫反应之间的关系，我们选择了一系列的免疫指标，然后转化为转位基因，发现PD-L1的表达与T细胞和巨噬细胞相关的免疫反应特别同步，但与B细胞谱系的免疫反应无关。根据相应的生物学过程，PD-L1对神经胶质瘤患者具有预测价值：较高的PD-L1水平，生存率明显较低，尤其是对于胶质母细胞瘤来说。

结论：PD-L1在胶质母细胞瘤中上调，并且与其它检查点成员由有协同作用。除此之外，PD-L1与T细胞的活化、巨噬细胞相关性免疫反应密切相关，并且预测患者的预后更差，这就需要对用于治疗潜在的神经胶质瘤的PD1/PD-L1的检查点抑制剂进行临床试验。

引言

胶质瘤是成人脑肿瘤中最常见和危害最大的肿瘤。尽管对于该病的认识越来越深刻，但是对于患有胶质母细胞瘤（最具侵袭性的脑肿瘤）的患者来说，其中位生存期只有15个月。大量的统计结果表明越来越多的人认识到胶质瘤与免疫之间的相互作用。程序性死亡配体1（PD-L1），也被称为簇分化274（CD274）或B7同源物（B7-H1）在一系列恶性肿瘤中得到广泛的报道，包括乳腺癌、T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤、非小细胞肺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、非透明细胞性肾细胞癌、胃肠道基质肿瘤及转移性膀胱癌等。PD-L1是一种跨膜蛋白，可能会在特定的条件下发挥其阻断肿瘤免疫周期的作用，如肿瘤的发生、妊娠、自生免疫性疾病及其他它疾病状态下。许多研究试图确定PD-L1的表达水平与预后的关系，并且已经得到了相对一致的结果。在恶性肿瘤患者中，高表达的PD-L1较低表达的PD-L1患者生存期更短。因此，在过去的十年中针对PD-1/PD-L1的治疗已经逐渐增多，旨在恢复肿瘤的免疫活性，但是不同的肿瘤有不同的反应率。

迄今为止，我们还没发现关于PD-L1在整个WHO级别的胶质瘤中表达的单一综合报告。只有Nduom等人提出的一项报告描述了在成人胶质瘤细胞中PD-L1的表达约占脑胶质瘤的40%。为了研究PD-L1在所有胶质瘤中的表达状态，我们利用中国胶质瘤基因组图谱（TCGA）数据库，包括全集胶质瘤的RNA seq数据和mRNA芯片数据。为了进一步明确我们在CGGA数据库中的发现，我们从TCGA网络中得到了神经胶质瘤的RNA seq数据，并且发现两个队列结果具有一致性。这是第一个对PD-L1在全分级胶质瘤中表达水平的分子和临床标征方面的综合研究。

方法

样本和数据收集

在CGGA数据库中，我们收集了301个转录数据样本，这些样本是由国家安捷伦全人类基因组芯片平台提供，样本分级范围从WHO分级的II级到IV级。在TCGA数据库中，全部WHO等级中的675个样本的RNAseq数据（等级3，RSEM归一化数据）是可用的，样本等级从WHO分级的II级到IV级。用TCGA RNA seq分析数据，RSEM值用对数转换。这样，总体来说，976个样本的PD-L1转录表达数据是可评估的。从患者本人（或其家属）那的得到CGGA项目的书面知情同意书。这项研究得到中国北京首都医科大学伦理委员会的批准。

胶质瘤生物标志物的检测

IDH1/2突变是胶质瘤中最常见的突变，发生在恶性程度较低的病变中，特别是在低级别的胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤中。在之前的研究中发现，对于CGGA队列，焦磷酸测序法可检测到DH1/2的突变。对于CGGA队列，IDH突变数据可从TCGA网站中下载得到，这些数据来自整个外显子测序或焦磷酸测序数据。

统计分析

R语言作为统计分析的主要工具并用来计算数据。使用生存数据包中的提供的coxph函数制作多变量cox比例风险模型。其它的数据是由几个R数据包表示的的，例如pheatmap、pROC、弦状图和corrgram函数。在需要用高斯分布进行数据分析之前进行高斯测试。p

结果

PD-L1在胶质母细胞瘤中表达上调，而在IDH突变胶质瘤中表达下调

由于不同神经胶质瘤分子性质的显著特异性，根据WHO等级系统和IDH突变状态分析301个具有mRNA微阵列数据样本中PD-H1的表达。在CGGA队列中，胶质母细胞瘤与II级和III级胶质瘤相比，PD-L1的表达水平更高。这个结果在TCGA RNA测序数据中得到验证，这进一步表明恶性程度较高的胶质瘤和其它之前报道过的恶性肿瘤中PD-L1有更高的表达。而且，在CGGA和TCGA数据集中，当IDH突变状态作为子分类器被纳入时，我们发现IDH野生型成人胶质细胞瘤与IDH突变型胶质母细胞瘤相比PD-L1的表达表现出明显不同的模式。此外，与不同级别的IDH突变型胶质瘤相比IDH突变型中PD-L1普遍表现出较高的表达，尽管在一些数据中没有统计学意义。这表明，在IDH野生型胶质瘤中PD-L1检查点相关免疫反应更为普遍，进一步体现了这两种不同肿瘤之间不同的生物模式。

PD-L1是间质分子亚型的潜在标志物

为了研究PD-L1与胶质瘤的分子相关性，我们调查了PD-L1在通过TCGA数据库被定义的不同分子亚型中的表达的分布情况。如图2A和2B所示，在CGGA和TCGA数据库中，PD-L1在间质亚型中显著上调相比于其他亚型，除了在在CGGA数据库中的经典亚型外，其虽然没有意义，但同样显示出上调的趋势。这一结果告诉我们PD-L1可能作为间质亚型的一个生物标记物。在CGGA和TCGA数据库中，对PD-L1表达和所有胶质瘤间质亚型进行了ROC曲线分析，曲线下面积分别为80.1%和80%（图2C和2D）。

PD-L1与其他检查位点成员在肿瘤诱导的免疫反应中具有协同作用

PD-L1是PD1配体中的一员，二者相结合可以通过抑制T细胞的功能来抑制免疫反应。Cortez等人研究发现一个新的机制，TP53可通过微小RNA-34调控PD-L1的表达，从而促进肿瘤的免疫逃逸。因此，我们把p53与PD-L、PD1、CD80和PD-L2的表达结合在一起分析。

皮尔逊的相关性研究就是在CGGA与TCGA数据库中应用这五个因素进行操作。在CGGA的全部分级胶质瘤中，PD-L1与PD1、PD-L2、CD80表现出较高的一致性，这就表明PD1/PD-L1通路很活跃（图，3A）。据我们所知，胶质母细胞瘤较低级别的胶质瘤更易引起更高的炎症反应和免疫应答，为了检测免疫检查位点在胶质母细胞瘤中的关系，皮尔逊另外进行了相关分析。如图3B所示：这些检查位点成员相互之间有着更高的相关性。在TCGA数据库中检查位点标记物同样具有较强的相关性，这与CGGA数据库是相一致的（图，3C和D），这就表明了这些标记物具有协同效应。此外，发现p53的表达与PD-L1的表达之间仅仅有很弱的相关性，这其中可能存在着干扰信号。

在临床或临床前试验中被评估为治疗目标的许多其他检查点成员，如Pardoll所综合鉴定的B7-H3、B7-H4、LAG-3和Tim-3、29、30被纳入了分析中，包括额外的免疫基因或免疫检查点。

据报道，TIM-3在高级别的胶质瘤中较低级别的病变中上调。Circos图表明，PD-L1表达与Tim-3和B7-H3密切相关（图4），这些结果提醒我们，当胶质瘤对PD-L1抑制剂产生耐药时，我们需要注意Tim-3或B7-H3的产生。

PD-L1的相关生物过程

PD-L1在不同级别胶质瘤中的表达存在异质性。为了研究具有不同PD-L1表达的胶质瘤的生物学特性在每一个数据库中我们要求的基因与PD-L1具有较强的相关生性，在CGGA和TCGA数据库分别总共有989和775个基因符合后续分析要求。为了获得准确的结果，选择由两个数据库共享的显著相关基因，用于进行基因本体分析，通过在线方法（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）。我们发现与PD-L1表达呈正相关的基因更多地参与免疫反应，尤其是T细胞的活化（图5A和B）。相反，与PD-L1表达呈负相关的的基因更多的参与在正常的生物学过程中，例如中枢神经系统神经元的分化和脊索动物胚胎的发育等。这就表明连同PD1和CD80在内的PD-L1可以在具有极度活跃的炎症和免疫反应的肿瘤环境中诱导产生更多的免疫抑制剂。如前所述，PD-L1在胶质母细胞瘤或间质分子亚型中表达更高，我们将胶质母细胞x瘤作为一组独特的胶质瘤，通过评估相关的生物学过程来扩大我们对胶质母细胞瘤的认识。进一步分析了两组数据中GBM所共有的显著相关基因，发现PD-L1除免疫应答高外，还与血管生成呈正相关（图S2A和B）。这一研究表明，PD-L1通路的激活与GBM的血管化相平行，提示胶质瘤具有更强的侵袭性。

PD-L1相关炎症反应

为了进一步了解PD-L1相关的炎症反应，我们选择了七个集群，共计104个基因，随后我们称其为metagenes8（表S1），其代表了不同类型的炎症和免疫反应。如图6A所示，在CGGA数据库中，多数组与PD-L1的表达呈正相关，除了IgG，其主要与T淋巴细胞的活性有关。为了验证我们在集群中的发现，七个集群得出基因簇对应基因簇的变异分析。PD-L1与HCK、LCK、和MCH-I呈正相关，但是与IgG呈负相关，这与我们在图6A所观察到的是一致的。我们观察到了CGGA数据库的胶质母细胞瘤相类似的模式。这些结果表明，当胶质瘤中巨噬细胞和T细胞信号转导被激活后，PD-L1作为免疫抑制因子被上调，而B系相关的免疫反应在胶质瘤中的作用不大，与PD1/PD-L1通路途经和T细胞相关基因表达特征之间的频繁相互作用相反。

PD-L1在胶质瘤中预示着不良预后

为了探究其对生存期的影响，我们检测了PD-L1在预后中的价值。在CGGA和TCGA的两个数据库中，分别有298名患者和622名患者的生存数据可以利用。如图7A和B，当把所有类型的胶质瘤考虑在内是，肿瘤中高表达PD-L1的患者，生存期明显短于相应的胶质瘤患者。由于不同级别的胶质瘤存在异质性，我们对两种数据库中的GBM的PD-L1表达的预后价值进行了研究（图7C和D）。当我们由PD-L1表达分组的两组时，我们观察到了与图7A和B相似的Kaplan-Meier曲线。这一结果表明，由于对T细胞相关的免疫抑制作用，从而使得PD-L1是个不良的预后因子。

总结

PD-L1在胶质母细胞瘤中表达上调，并与其他检查位点成员协调作用。此外，PD-L1与T细胞活化和巨噬细胞相关免疫反应密切相关，对患者来说预示着不良的生存，确保PD1/PD-L1检查位点抑制剂临床试验，将成为胶质瘤潜在的治疗。

讨论

胶质瘤是成人最常见的原发性恶性肿瘤。诊断后手术、化疗和放疗相结合的治疗对胶质瘤的治疗仅起到了有限的改善。胶质瘤在相对独立免疫的中枢神经系统生成发展，在相对免疫抑制的微环境中充分生长。免疫治疗已成为胶质瘤的一种越来越引人注目的治疗方法，尤其是在GBM中，在胶质瘤的治疗中散发出耀眼的光芒，。

我们还注意到，当我们完成这篇手稿时，一项关于胶质母细胞瘤（占胶质瘤的40%）中PD-L1表达的研究已经发表在神经肿瘤学上。为了进一步解决在胶质瘤中PD-L1表达的作用和其分布，我们扩张我们的分析范围，将将所有不同级别的胶质瘤做综合的研究。随着免疫治疗在恶性肿瘤的治疗中变得越来越重要，对胶质瘤中PD-L1的初步研究是非常必要的。本次研究利用CGGA和TCGA数据库，共976份样本进行分析。我么发现PD-L1表达在较高级别的胶质瘤和间质亚类型中上调，这就表明PD-L1的表达与与更恶性的生物学过程相关。此外，PD-L1可作为间质亚型的指标，。PD-L1的低表达通常伴随着IDH的突变，表明IDH突变的胶质瘤中肿瘤诱导的免疫反应要低于IDH野生型胶质瘤。

PD-L1与PD1、PD-L2、CD80协同表达，并参与PD1/PD-L1通路。通过7个免疫相关簇，我们发现PD-L1的表达与T细胞的活化、巨噬细胞相关的免疫反应和干扰素激活的概率呈正相关。这一结果与PD1/PD-L1通路的主要功能相一致，其功能是在肿瘤中抑制T细胞的功能。免疫反应是由肿瘤相关的病理过程诱导的，特别是在相对免疫占优势的环境之中。Louveeau在中枢神经系统中发现了淋巴管，为胶质瘤中T细胞的度活性提供了有力的证据和解释。此外，巨噬细胞相关基因信号的高表达可能来源于小胶质细胞，这些细胞被认为是大脑和脊髓的驻留巨噬细胞，在中枢神经系统中起着免疫防御的作用。

此外，对于胶质瘤患者来说，PD-L1的表达预示着更差的生存期。当GBM作为胶质瘤的独特类型被观察是，也看到了这种预后价值。有趣的是，PD-L1似乎与血管生成密切相关，与低级别胶质瘤相比，这就与GBM的高度血管化相一致，这进一步验证了PD-L1的表达与恶性过程之间的关系。

许多临床前和临床试验已经进行研究了阻断PD1/PD-L1通路的效果，并观察到在许多恶性肿瘤中的持久抗肿瘤作用。本研究证实了PD-L1在胶质瘤中的表达高度活跃，尤其是在GBM中。应用特异性免疫检查位点抑制剂治疗胶质瘤的临床研究似乎是有必要的。同时，对肿瘤微环境的构成评价应包括在临床试验之内。因此，我们提议把PD-L1的阻断作为治疗人类胶质瘤的新方法。

关于神经系统肿瘤前人已经做了出色的工作，我们应该聚焦于胶质母细胞瘤PD-L1的表达及预后价值。我们扩大研究范围，包括WHO-II到WHO-IV级。这就广泛的扩张了PD-L1的研究范围。