太牛了！中山大学团队凭借自己开发的新技术，发现了新类型非编码RNA

Kink-turn（K-turn）结构是一类几乎存在于所有生物中的三级RNA结构基序，广泛存在于mRNA及各类ncRNA中，其结构及结合蛋白15.5K在RNA代谢和疾病发生发展过程中发挥重要的调控功能。

然而，由于目前缺乏有效的实验与计算机技术去鉴定具有K-turn结构的RNA（ktRNA），因此K-turn结构在转录组中的分布、表达、结构特性及功能机制都有待全面阐释。

近日，中山大学生命科学学院相关研究团队在NatureBiotechnology（68分）期刊发表了相关研究，该研究开发了RIP-PEN-seq/PEN-seq/sub-PEN-seq等测序技术和kturnSeeker算法，发现在固定位置出现后向（backward）K-turn结构和序列基序的新类型ncRNA——bktRNA，并解析了它们的表达、折叠结构特性及其在RNA剪接和修饰中的功能机制，为发现新的ktRNA/ncRNA及其功能机制研究提供了新方法和新思路。

接下来，梅斯小编将带大家一起来解读一下这篇文章的研究思路，了解其研究方法及内容。

一、研究思路图

二、研究结果

1、开发RIP-PEN-seq测序技术和kturnSeeker算法，发现了一类具有后向K-turn基序RNA(bktRNA)及其序列结构跟特征

因为RIP-seq和RNA-seq方法等实验技术限制原因，无法测定全长的ncRNA且不能发现ncRNA上的序列和结构基序及其距离RNA末端的精确位置。对此，作者开发RNA免疫沉淀与ncRNA配对末端测序（RIP-PEN-seq）相结合的方法，去测定人和小鼠中与15.5K蛋白互作的全长ncRNA分子（20-500个核苷酸）。此外，还开发了一种名为kturnSeeker的计算工具，根据RIP-PEN-seq数据中的序列和二级结构信息来识别潜在的ktRNA。最终，发现605个此前未描述的fktRNA以及118新的后向fktRNA。

通过结构和基序富集分析这些新的后向ktRNA，研究者探究了btkRNA的结构和序列特征，发现它们都具有以下的特征：具有后向K-turn结构基序；大多数后向K-turn结构基序分别位于距离RNA5'端4个核苷酸和3'端2个核苷酸处；保守序列CUGA在后向K-turn结构的5'端富集跟保守序列UGAUG在后向K-turn结构的3'端富集。

作者采用实验验证上述结果，基于这些规律性特征，它们被命名为具有规律性后向K-turn结构基序的新类型ncRNA——bktRNA。

2、评估bktRNA的折叠特性、表达模式、序列保守性和进化模式

为了鉴定人体组织和细胞中的bktRNA，研究者将kturnSeeker工具应用于由PEN-seq方法生成的28个小RNA测序（sRNA-seq）数据集和ENCODE联盟生成的234个公共sRNA-seq数据集，发现了379个高置信度候选bktRNA。

接下来，研究者通过对bktRNA进行结构折叠（folding）特性分析，发现它们与其它依赖金属离子折叠的ktRNA明显不一样。进一步地分析bktRNA与m6甲基化网站后，发现反向K-turn结构的序列组成以及与RBP的相互作用可能有助于bktRNA的折叠。此外，研究者还检测了bktRNA在细胞和组织中的表发情况，发现大部分bktRNA存在于细胞核中。

3、发现bktRNA1与U12 snRNA相互作用，以bktRNA1为例子探究bktRNA调节功能

为了鉴定bktRNA的直接靶标，研究者通过15.5K蛋白的CLASH测序，发现、bktRNA1与minor splicesome（次要剪接体）中的U12 snRNA形成14个碱基的互补配对。RNA-RNA互作实验还表明，bktRNA1和U12在体内形成RNA双链体。荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）实验证实bktRNA1和U12与15.5K蛋白共定位，可见U12snRNA是bktRNA1的直接靶标。

（一）bktRNA1调节U12 snRNA的2′-O-甲基化

U12 snRNA和bktRNA1之间的互补区域内存在2′-O-甲基化位点，因此作者猜想bktRNA1可能指导2'-O-甲基转移酶FBL催化U12的2'-O-甲基化修饰。

接着，作者开发了一种红外引物延伸（irPE）方法并利用CRISPR/Cas9敲除技术和回复实验等技术来验证猜想，证实了bktRNA1及其后向K-turn结构基序对于介导U12 snRNA的第八位腺嘌呤核苷酸（Am8）的2'-O-甲基化修饰是必不可少的。

（二）bktRNA1的耗竭导致U12型内含子失调

作者进一步猜想：bktRNA1及其修饰是否是人类细胞中U12型内含子剪接所必需的，并进行验证。作者在所有四种bktRNA1-KO细胞系中进行了RNA-seq测序及剪接分析，发现bktRNA1的耗竭影表明响了超过75%的U12型内含子。进一步采用qPCR、RT-PCR和回复实验发现，bktRNA1的缺失对U12型内含子的剪接具有全局影响。

（三）bktRNA1调节ZCRB1募集到次要剪接体

作者进一步验证bktRNA1的缺失是否干扰次要剪接体成分的组装，采用Northern Blot、ChIRP、RNApull-down和RNA EMSA等实验技术来验证猜想，发现bktRNA1的缺失导致ZCRB1不能结合到次要剪接体。对敲低ZCRB1的细胞进行分析后发现，bktRNA1与ZCRB1对U12内含子剪接及细胞表型影响都是一致的，这表明bktRNA1介导的U12 RNA上2'-O-甲基化修饰对于ZCRB1募集到次要剪接体是必不可少的。

4、bktRNA调节局部内含子的剪接

明确了bktRNA的功能外，作者基于bktRNA普遍位于内含子内，并且它们的结合伙伴15.5K可以促进次要和主要剪接体的组装，猜想bktRNA可能参与调节内含子加工和RNA剪接并进行验证。结果显示，bktRNA以后向K-turn基序依赖性方式参与内含子剪接的局部调控。

三、小结

本研究构建了多种新的实验方法，鉴定到一类新的转录后调节因子RNA——bktRNA，并通过多种实验技术发现bktRNA的结构及功能，且bktRNA可以在内含子的剪接过程中充当局部调节因子。

这些发现揭示了由bktRNA、RNA甲基化和RNA剪接体的相互作用形成的新层次基因表达调控机制，给予研究者一个新的研究方向，为发现新的ktRNA/ncRNA及阐释它们在细胞和疾病中的功能机制研究提供了研究方法及思路。

参考链接：

链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37037902/

撰写：MIE