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    第二代测序原理的详细解析!

    第二代测序(Next-generation sequencing,NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing),是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序,而二代测序开创性的引入了可逆终止末端,从而实现边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中,单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇,然后进行同步复制,来增强荧光信号强度从而读出DNA序列;而随着读长增长,基因簇复制的协同性降低,导致碱基测序质量下降,这严格限制了二代测序的读长(不超过500bp),因此,二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序(例如16S、18S、ITS的可变区),而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法(Shotgun method)打断成小片段,测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。

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