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文献分享（xenium）--人类小胶质细胞和脑血管周巨噬细胞在衰老和阿尔茨海默病中的可塑性

原创

追风少年i

修改于 2026-08-16 08:08:49

560

作者，Evil Genius

今日我们分享xenium的文献，多组学是必然的趋势，基因组 + 单细胞空间 + 分子对接/分子动力学是必然的组合，大家有能力，最好把整个组学内容连串起来。

知识积累

髓系细胞（myeloid cells），包括小胶质细胞（microglia）和血管周围巨噬细胞（perivascular macrophages），在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的神经生物学过程中发挥核心作用，但其具体作用机制仍未得到充分阐明。

MITF是调控这一疾病相关小胶质细胞状态的上游调控因子，并且维持该细胞状态需要MITF的作用。

通过细胞–细胞相互作用（cell–cell interaction）分析，研究进一步筛选出了与疾病进展相关的重要配体–受体信号轴，其中包括：

APOE–SORL1

APOE–TREM2

最后，通过人类和小鼠模型，证明，这种疾病相关小胶质细胞亚型所产生的神经保护作用依赖于TREM2。

第一队列：

研究者从新鲜的尸检组织中分离出具有活性的离体人类髓系细胞（viable ex vivo human myeloid cells），共纳入137名供体，并对这些细胞进行了深度测序，同时分析了细胞核RNA和细胞质RNA。

第二队列：

研究者利用冷冻组织，获得人类髓系细胞细胞核（human myeloid nuclei），该队列规模更大、个体来源更加广泛，共包含1,470名供体。

综合两个队列，研究者获得了一个人群规模（population-scale）的人类髓系细胞转录组数据集：

>1,600名供体

>830,000个髓系细胞

来源于人类前额叶皮层

同时覆盖不同年龄、AD病理阶段以及遗传风险背景

基于这一大规模人类髓系细胞转录组数据，研究主要围绕两个目标展开。

第一：建立人类髓系细胞的系统分类体系

通过综合考虑人类髓系细胞转录组的深度（depth）和广度（breadth），研究者建立了一个具有可重复性（reproducible）的细胞分类体系（taxonomy）。

同时，研究揭示了小胶质细胞和血管周围巨噬细胞（PVMs）具有高度动态的可塑性（plasticity）。这种可塑性会随着以下因素发生变化：

年龄/生命周期

AD病理阶段

AD遗传易感性（genetic liability）

也就是说，小胶质细胞并不是一个固定不变的细胞群，而是会随着衰老、AD病理以及遗传风险发生持续的状态转换。

第二：解析TREM2–MITF–GPNMB调控通路

进一步整合了：

遗传学分析 + 转录组学分析 + 功能实验

从机制层面明确建立了一个关键调控通路：

TREM2 signaling → MITF activation → GPNMB activation

即：

TREM2信号激活 → MITF介导的转录调控 → GPNMB表达/激活 → 特定疾病相关小胶质细胞状态

这一结果为理解AD相关小胶质细胞如何产生以及发挥功能提供了重要的机制依据。

结果1、人类髓系细胞的细胞分类体系

对来自1,607名不同供体（unique donors）前额叶皮层（PFC）的832,505个人类髓系细胞进行了分析。

1. 两个独立的数据集

第一个数据集为FreshMG。

FreshMG数据集来自137名不同的尸检供体的新鲜脑组织，这些供体来自两个脑组织库。样本涵盖了不同程度的AD神经病理改变，同时也包括神经系统典型（neurotypical）的对照个体。

FreshMG供体年龄为26～107岁，平均年龄为80.7岁，其中：

女性：76人

男性：61人

为了富集髓系细胞，研究者首先利用荧光激活细胞分选（FACS）分离具有活性的CD45⁺细胞。

此外，在其中3名供体中，每名供体设置8个技术重复，研究者进一步利用CITE-seq检测细胞表面蛋白标志物，共使用154种不同抗体，最终从新鲜脑组织获得了161个scRNA-seq文库。

经过严格的质量控制（QC）和初步聚类后，研究者发现了一个数量较大且相对均一的髓系细胞群，同时还发现了一些少量的共纯化免疫细胞，包括：

单核细胞（monocytes）

中性粒细胞（neutrophils）

T细胞

NK细胞

B细胞

其中，髓系细胞群包含543,012个小胶质细胞和血管周围巨噬细胞（PVMs），这些细胞能够稳定表达23,740个基因。

第二个数据集为PsychAD。

PsychAD由冷冻的前额叶皮层（PFC）组织构成，包括来自1,470名不同供体的病例和对照样本。

PsychAD供体年龄范围为0～108岁，平均年龄为71.3岁，其中：

女性：761人

男性：709人

研究者对冷冻组织进行snRNA-seq分析，并在完成基础聚类后，通过计算方法（in silico）从中筛选出小胶质细胞和PVM细胞核。

经过严格QC后，共鉴定出：

289,493个小胶质细胞和PVM细胞核

这些细胞核能够稳定表达34,890个基因。

2. 两个数据集与AD病理的关系

随后，研究者对两个数据集中的临床变量进行了统一和标准化，以便进行细胞注释和跨队列比较。

结果发现，细胞数据与AD神经病理严重程度之间存在很强的正相关关系。

尤其是以下三个AD病理指标：

AD诊断确定性（diagnostic certainty of AD）

CERAD评分

Braak分期

均表现出明显的相关性。

相比之下，痴呆严重程度（dementia severity）与AD病理之间的相关性相对较弱。

3. 为什么需要建立两个数据集的交叉验证？

研究的主要目标是建立一个全面、稳定并且具有可重复性的人类髓系细胞分类体系（cellular taxonomy）。

但是，直接将两个大规模单细胞数据集进行比较存在技术上的困难。

原因在于两个数据集的转录组来源不同：

FreshMG：

完整细胞 → whole-cell transcriptome

PsychAD：

细胞核 → nuclear transcriptome

因此，两者存在明显的技术差异。

为了解决这一问题，设计了一套迭代式交叉验证策略（iterative cross-validation strategy）。

基本思路是：

建立一个参考细胞状态
↓
在另一个独立数据集中验证
↓
根据结果调整参考状态
↓
再次进行独立验证
↓
直到两个数据集达到一致

研究者首先利用FreshMG数据集建立参考体系，因为FreshMG同时提供了细胞核和细胞质RNA的转录组信息，因此能够更加全面地识别小胶质细胞和PVM的功能状态。

随后，在冷冻组织来源的PsychAD snRNA-seq数据集中，对这些参考亚型进行交叉验证。

最终，这种迭代过程确定了：

13种具有不同功能特征的人类髓系细胞亚型

而且FreshMG和PsychAD两个队列之间具有高度一致性，所有细胞亚型的平均Pearson相关系数达到0.77。

这说明该分类体系具有较好的稳定性和可重复性。

4. 13种亚型被归为6大功能类别

研究者进一步将13种髓系细胞亚型划分为6个大的功能性亚类：

功能亚类	英文	图中颜色
稳态型	Homeostatic	绿色
适应型	Adaptive	蓝色
增殖型	Proliferative	黄色
AD相关小胶质细胞（ADAM）	AD-associated microglia	红色
离体激活型小胶质细胞（exAM）	Ex vivo activated microglia	粉色
血管周围巨噬细胞	PVM	橙色

每一种亚型都有特异性的marker genes，这些marker不仅能够用于细胞鉴定，也能够提示其潜在功能。

5. Homeostatic：稳态型小胶质细胞

稳态型小胶质细胞中主要鉴定出两个亚型：

CECR2亚型

主要表达：

CECR2

NAV2

同时，其表达的其他基因提示该亚型可能参与：

细胞维持

吞噬

细胞迁移

细胞黏附

GTPase活性调控

PICALM亚型

主要表现为：

PICALM高表达

ELMO1高表达

提示其可能参与免疫反应调控。

总体而言，稳态型小胶质细胞是所有髓系细胞中比例最大的群体。

它们表达经典的小胶质细胞marker，例如：

P2RY12

CX3CR1

6. Adaptive：适应型小胶质细胞

发现了7种特殊的适应型小胶质细胞亚型。

这些细胞能够针对不同的神经微环境刺激（neuro-environmental cues）产生特异性的适应性反应。

总体来看，这些适应型小胶质细胞具有共同的功能特征：

抗原加工和抗原呈递增强

并且促进：

MHC蛋白复合物的组装

具体包括以下亚型。

CCL3亚型

主要表现为趋化相关基因上调，尤其是炎症因子：

CCL3

CCL4

提示其具有较明显的炎症/趋化功能。

IFI44L亚型

富集干扰素诱导基因，包括：

IFIT1
IFIT2
IFIT3

提示其可能参与抗病毒先天免疫反应。

AIF1、HIF1A和HIST亚型

这三个亚型共享一个与：

免疫球蛋白介导的免疫反应

TMEM163亚型

主要表现为：

MHC II介导的抗原加工和抗原呈递相关基因程序增强。

HSPA1A亚型

富集与未折叠蛋白适应性反应（adaptive response to unfolded protein）相关的基因。

其主要特征包括：

热休克蛋白活性增强
细胞应激反应增强

并且可能参与AD神经病理过程。

7. GPNMB：AD相关小胶质细胞（ADAM）

鉴定出一个名为：

GPNMB的髓系细胞亚型。

这种细胞主要存在于AD个体中。

因此将其归入：

AD-associated microglia，ADAM

即AD相关小胶质细胞。

GPNMB细胞具有较高表达的：

GPNMB
MITF
PTPRG

功能富集分析进一步表明：

增强的吞噬活性（phagocytic activity）是GPNMB细胞的重要特征。

这与前面摘要中提到的结果相呼应：

AD病理增加 → GPNMB小胶质细胞扩增 → 吞噬能力增强

8. MKI67：增殖型小胶质细胞

还发现了一个增殖型细胞群：

MKI67亚型

该细胞群高度富集细胞周期相关基因，例如：

MKI67
HELLS
CLSPN

说明该群体具有明显的：

细胞增殖/细胞周期活性

9. ERN1：ex vivo激活型相关细胞

还发现了一个：

ERN1亚型

该亚型特异性表达：

ERN1
PLK2

其表达模式与之前报道的ex vivo activated microglia（exAM）较为相似。

也就是说，这一细胞状态可能部分反映了：

细胞从脑组织中分离出来后受到操作/离体环境刺激而产生的激活状态。

10. CD163：血管周围巨噬细胞（PVM）

除了小胶质细胞亚型之外，研究者还鉴定出了一个明确的：

PVM亚型——CD163

该细胞表达一组典型的PVM marker，尤其包括：

CD163
F13A1

CD163亚型显著富集与内吞作用（endocytosis）相关的基因。

这表明PVM具有较强的：

受体介导的内吞作用

以及：

吞噬作用

11. GPNMB小胶质细胞与PVM如何区分？

值得注意的是，ADAM和PVM在转录组上具有一定相似性。

但是通过进一步富集：

小鼠疾病相关小胶质细胞（DAM）signature
人iPSC来源小胶质细胞的DAM signature

发现：

ADAM和PVM实际上能够被清晰地区分。

因此，GPNMB并不是简单地代表PVM，而是属于一个真正的AD相关小胶质细胞状态。

12. AD遗传风险与不同髓系细胞亚型

进一步使用：

scDRS（single-cell Disease Risk Score）

在单细胞水平估算不同遗传性疾病风险与髓系细胞亚型之间的关联。

除了AD之外，还分析了其他脑部疾病，包括：

精神分裂症（schizophrenia）
双相情感障碍（bipolar disorder）
重度抑郁症（major depressive disorder）
自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder）
多发性硬化（MS）
肌萎缩侧索硬化（ALS）
帕金森病（Parkinson’s disease）

FreshMG和PsychAD两个队列中，各疾病的多基因风险评分（polygenic scores）具有高度可重复性。

其中：

AD和MS的相关性最高。

13. 哪些细胞亚型与AD遗传风险相关？

对FreshMG和PsychAD进行meta-analysis后发现：

9种髓系细胞亚型与遗传性AD风险显著相关。

这是所有研究脑部疾病中数量最多的。

之后依次为：

MS → 精神分裂症 → 重度抑郁症

特别值得注意的是：

GPNMB亚型具有最广泛的疾病遗传风险覆盖范围。

它与研究分析的8种疾病全部存在显著的遗传风险关联。

这进一步说明GPNMB细胞可能处于一种具有广泛免疫/疾病相关特征的特殊状态。

14. 最终验证：建立人类髓系细胞参考分类体系

为了证明这套分类体系可以作为：

人类髓系细胞参考taxonomy（reference human myeloid taxonomy）

进一步在多个独立数据集中验证了全部13种细胞亚型。

验证范围包括：

独立的单细胞数据集
活体脑组织
多组学数据
不同的空间组学技术
正交空间检测方法（orthogonal spatial assays）

最终发现：

无论组织来源还是测序/检测技术如何变化，这13种髓系细胞亚型均具有较好的可重复性。

因此，这项研究建立了一套相对稳定的人类髓系细胞分类框架，为后续研究衰老、AD病理、遗传风险以及TREM2–MITF–GPNMB机制奠定了基础。

结果2、人类髓系细胞亚型在衰老和AD中的组成变化

在确定了13种人类脑髓系细胞亚型后，进一步分析这些亚型在正常衰老和AD进展过程中比例如何变化。

1. 正常衰老导致髓系细胞组成发生变化

在没有痴呆和明显神经病理改变的健康老年人中分析发现：

CECR2稳态小胶质细胞：随年龄增加而逐渐减少
PICALM稳态小胶质细胞：随年龄增加而逐渐增加
GPNMB亚型：随年龄中度增加
CD163（PVM）亚型：随年龄中度增加
CCL3亚型：随年龄下降，提示老年脑中趋化型小胶质细胞可能减少

这一结果在其他已发表的人类小胶质细胞snRNA-seq数据中也得到了验证。

此外，男性和女性之间的髓系细胞亚型组成没有显著差异。

2. AD进展进一步改变髓系细胞组成

研究者进一步分析≥40岁的供体：

FreshMG：134人
PsychAD：1,314人

无论使用哪一种AD严重程度指标：

AD诊断（dx_AD）
CERAD
Braak分期
痴呆程度

均观察到了明显的髓系细胞亚型组成变化。

其中最重要的变化包括：

亚型	AD进展中的变化
CECR2	↓ 持续下降
PICALM	↑ 持续增加
CD163	↑ 中度增加
GPNMB	↑↑ 显著增加

其中CECR2和PICALM呈现与正常衰老类似的相反变化。

值得注意的是：

AD相关变化在Braak stage 3之后明显加剧。

说明髓系细胞组成变化可能在AD病理发展到一定阶段后进一步加速。

结果3、人类髓系细胞在衰老和AD过程中转录调控的变化

衰老相关的转录变化：

基因水平：正常衰老过程中，MS4A6A 基因表达增加，该基因与神经退行性过程有关。

细胞功能：稳态小胶质细胞（CECR2, PICALM）的衰老相关变化富集在细胞骨架组织和粘附/迁移通路。而PVM（CD163）和ADAM（GPNMB）亚型则更多地与炎症反应上调相关，表明衰老伴随炎症加剧。

AD相关的转录变化：

关键基因：发现一组在AD各表型中均上调的基因，如 PTPRG、DPYD、IL15。

组成变化验证：通过对比独立批量测序数据，证实了AD状态下，PICALM、CD163、GPNMB等亚型特征与AD病例高度相关，而CECR2等亚型则与对照更相关，重现了单细胞水平观察到的AD相关细胞组成变化。

疾病进程拟时间分析：

构建了基于Braak分期的“拟时间”轨迹来模拟疾病进展。

发现 PICALM 亚型与疾病的晚期阶段相关，而CECR2与早期相关。

关键的细胞组成和转录变化拐点出现在 Braak 3期，提示该阶段是AD进展的关键节点。

上游转录调控因子的发现（核心发现）：

通过构建基因调控网络（GRNs），筛选出与AD风险基因显著相关的转录因子。

确定了三个关键的调控因子（Regulons）：

MITF：其靶基因优先与上调的AD基因相关。

KLF12 和 GLIS3：其靶基因优先与下调的AD基因相关。

这三个转录因子在ADAM（特别是GPNMB亚型）中协同作用，调控包括吞噬作用、细胞因子产生等关键功能。

机制验证与通路解析（实验验证）：

核心问题：MITF和GPNMB如何影响AD病理？

实验模型：在人小胶质细胞系中使用CRISPR激活技术，过表达MITF或GPNMB。

关键结果：

过表达 MITF 或 GPNMB 均能增强对 Aβ淀粉样蛋白和凋亡神经元的吞噬作用。

MITF的促吞噬效果强于GPNMB，但在面对“髓鞘”底物时，两者均无效，显示底物特异性。

使用抑制剂阻断MITF通路后，GPNMB过表达带来的促吞噬效应被取消，表明GPNMB的作用依赖于上游的MITF信号。

体内验证：在AD小鼠模型（5xFAD）中，MITF调控活性确实升高，而这种升高依赖于TREM2基因。

总结：

这项研究不仅描绘了衰老和AD进程中髓系细胞的转录组变化图谱，更深入地揭示了MITF 作为一个核心上游调控因子，通过调控包括 GPNMB 在内的下游靶基因，以底物特异性的方式影响小胶质细胞的吞噬功能，从而参与AD的发病和进展。这为理解AD的细胞和分子机制提供了新的视角，并可能为药物开发提供新的靶点（如MITF通路）

结果4、影响ADAM的非细胞自主机制

细胞间通讯（CCI）网络分析：

方法：使用LIANA工具，基于配体-受体相互作用，分析不同AD阶段髓系细胞间的通讯变化。

关键发现：

在AD中，APOE-SORL1 和 APOE-TREM2 这两对相互作用的强度显著增加，被确定为最重要的AD相关CCI。

GPNMB亚型是AD中上调CCI网络的核心“接收”节点，特别是接收来自APOE-TREM2的信号。

与GPNMB相关的CCI通路富集在脂质代谢和蛋白水解调节，这些过程与AD病理密切相关。

TREM2对GPNMB亚型的关键调控作用：

人类遗传证据：携带高风险 TREM2 基因变异（如R47H）的个体，其GPNMB表达水平更低，并且在AD进展过程中，GPNMB亚型的细胞比例并未扩增。这提示GPNMB亚型的出现和功能依赖于完整的TREM2信号。

小鼠模型验证：在AD小鼠模型（5xFAD）中，GPNMB亚型比例增加，但在 Trem2基因敲除的5xFAD小鼠中，这种增加现象消失，进一步证实了TREM2的必要性。

功能验证与机制解析（实验部分）：

细胞模型：使用TREM2基因敲除（杂合/纯合）的人诱导多能干细胞（iPSC）衍生小胶质细胞。

关键结果：

TREM2缺失导致 GPNMB 和 MITF 的mRNA表达下降约50%。

TREM2缺失显著降低了细胞对 Aβ、髓鞘和突触蛋白的吞噬能力。

抑制MITF通路同样会降低Aβ吞噬，表明 MITF 是TREM2下游的关键效应分子。

直接证据：通过流式细胞术分选出吞噬能力高和低的小胶质细胞群体，发现高吞噬活性细胞中GPNMB的蛋白和mRNA水平均显著更高，直接将GPNMB表达与吞噬功能联系起来。

核心结论总结：

这项研究描绘了一条清晰的AD相关分子通路：

AD病理 → TREM2信号激活 → 上调MITF转录因子 → 促进GPNMB表达 → 增强小胶质细胞对Aβ等底物的特异性吞噬 → 试图清除病理蛋白

其中，TREM2 是启动该通路的关键受体，GPNMB 是执行吞噬功能的关键效应分子，而GPNMB亚型是这一过程的主要细胞载体。该通路具有底物特异性（对Aβ和凋亡神经元有效，对髓鞘无效）。这为理解AD中小胶质细胞的功能失调提供了机制层面的解释，并提示TREM2-MITF-GPNMB轴可能是潜在的干预靶点。

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数据分析

#单细胞

#空间

#数据分析

作者，Evil Genius

今日我们分享xenium的文献，多组学是必然的趋势，基因组 + 单细胞空间 + 分子对接/分子动力学是必然的组合，大家有能力，最好把整个组学内容连串起来。

知识积累

髓系细胞（myeloid cells），包括小胶质细胞（microglia）和血管周围巨噬细胞（perivascular macrophages），在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的神经生物学过程中发挥核心作用，但其具体作用机制仍未得到充分阐明。

MITF是调控这一疾病相关小胶质细胞状态的上游调控因子，并且维持该细胞状态需要MITF的作用。

通过细胞–细胞相互作用（cell–cell interaction）分析，研究进一步筛选出了与疾病进展相关的重要配体–受体信号轴，其中包括：

APOE–SORL1

APOE–TREM2

最后，通过人类和小鼠模型，证明，这种疾病相关小胶质细胞亚型所产生的神经保护作用依赖于TREM2。

第一队列：

研究者从新鲜的尸检组织中分离出具有活性的离体人类髓系细胞（viable ex vivo human myeloid cells），共纳入137名供体，并对这些细胞进行了深度测序，同时分析了细胞核RNA和细胞质RNA。

第二队列：

研究者利用冷冻组织，获得人类髓系细胞细胞核（human myeloid nuclei），该队列规模更大、个体来源更加广泛，共包含1,470名供体。

综合两个队列，研究者获得了一个人群规模（population-scale）的人类髓系细胞转录组数据集：

>1,600名供体

>830,000个髓系细胞

来源于人类前额叶皮层

同时覆盖不同年龄、AD病理阶段以及遗传风险背景

基于这一大规模人类髓系细胞转录组数据，研究主要围绕两个目标展开。

第一：建立人类髓系细胞的系统分类体系

通过综合考虑人类髓系细胞转录组的深度（depth）和广度（breadth），研究者建立了一个具有可重复性（reproducible）的细胞分类体系（taxonomy）。

同时，研究揭示了小胶质细胞和血管周围巨噬细胞（PVMs）具有高度动态的可塑性（plasticity）。这种可塑性会随着以下因素发生变化：

年龄/生命周期

AD病理阶段

AD遗传易感性（genetic liability）

也就是说，小胶质细胞并不是一个固定不变的细胞群，而是会随着衰老、AD病理以及遗传风险发生持续的状态转换。

第二：解析TREM2–MITF–GPNMB调控通路

进一步整合了：

遗传学分析 + 转录组学分析 + 功能实验

从机制层面明确建立了一个关键调控通路：

TREM2 signaling → MITF activation → GPNMB activation

即：

TREM2信号激活 → MITF介导的转录调控 → GPNMB表达/激活 → 特定疾病相关小胶质细胞状态

这一结果为理解AD相关小胶质细胞如何产生以及发挥功能提供了重要的机制依据。

结果1、人类髓系细胞的细胞分类体系

对来自1,607名不同供体（unique donors）前额叶皮层（PFC）的832,505个人类髓系细胞进行了分析。

1. 两个独立的数据集

第一个数据集为FreshMG。

FreshMG数据集来自137名不同的尸检供体的新鲜脑组织，这些供体来自两个脑组织库。样本涵盖了不同程度的AD神经病理改变，同时也包括神经系统典型（neurotypical）的对照个体。

FreshMG供体年龄为26～107岁，平均年龄为80.7岁，其中：

女性：76人

男性：61人

为了富集髓系细胞，研究者首先利用荧光激活细胞分选（FACS）分离具有活性的CD45⁺细胞。

此外，在其中3名供体中，每名供体设置8个技术重复，研究者进一步利用CITE-seq检测细胞表面蛋白标志物，共使用154种不同抗体，最终从新鲜脑组织获得了161个scRNA-seq文库。

经过严格的质量控制（QC）和初步聚类后，研究者发现了一个数量较大且相对均一的髓系细胞群，同时还发现了一些少量的共纯化免疫细胞，包括：

单核细胞（monocytes）

中性粒细胞（neutrophils）

T细胞

NK细胞

B细胞

其中，髓系细胞群包含543,012个小胶质细胞和血管周围巨噬细胞（PVMs），这些细胞能够稳定表达23,740个基因。

第二个数据集为PsychAD。

PsychAD由冷冻的前额叶皮层（PFC）组织构成，包括来自1,470名不同供体的病例和对照样本。

PsychAD供体年龄范围为0～108岁，平均年龄为71.3岁，其中：

女性：761人

男性：709人

研究者对冷冻组织进行snRNA-seq分析，并在完成基础聚类后，通过计算方法（in silico）从中筛选出小胶质细胞和PVM细胞核。

经过严格QC后，共鉴定出：

289,493个小胶质细胞和PVM细胞核

这些细胞核能够稳定表达34,890个基因。

2. 两个数据集与AD病理的关系

随后，研究者对两个数据集中的临床变量进行了统一和标准化，以便进行细胞注释和跨队列比较。

结果发现，细胞数据与AD神经病理严重程度之间存在很强的正相关关系。

尤其是以下三个AD病理指标：

AD诊断确定性（diagnostic certainty of AD）

CERAD评分

Braak分期

均表现出明显的相关性。

相比之下，痴呆严重程度（dementia severity）与AD病理之间的相关性相对较弱。

3. 为什么需要建立两个数据集的交叉验证？

研究的主要目标是建立一个全面、稳定并且具有可重复性的人类髓系细胞分类体系（cellular taxonomy）。

但是，直接将两个大规模单细胞数据集进行比较存在技术上的困难。

原因在于两个数据集的转录组来源不同：

FreshMG：

完整细胞 → whole-cell transcriptome

PsychAD：

细胞核 → nuclear transcriptome

因此，两者存在明显的技术差异。

为了解决这一问题，设计了一套迭代式交叉验证策略（iterative cross-validation strategy）。

基本思路是：

研究者首先利用FreshMG数据集建立参考体系，因为FreshMG同时提供了细胞核和细胞质RNA的转录组信息，因此能够更加全面地识别小胶质细胞和PVM的功能状态。

随后，在冷冻组织来源的PsychAD snRNA-seq数据集中，对这些参考亚型进行交叉验证。

最终，这种迭代过程确定了：

13种具有不同功能特征的人类髓系细胞亚型

而且FreshMG和PsychAD两个队列之间具有高度一致性，所有细胞亚型的平均Pearson相关系数达到0.77。

这说明该分类体系具有较好的稳定性和可重复性。

4. 13种亚型被归为6大功能类别

研究者进一步将13种髓系细胞亚型划分为6个大的功能性亚类：

每一种亚型都有特异性的marker genes，这些marker不仅能够用于细胞鉴定，也能够提示其潜在功能。

5. Homeostatic：稳态型小胶质细胞

稳态型小胶质细胞中主要鉴定出两个亚型：

CECR2亚型

主要表达：

CECR2

NAV2

同时，其表达的其他基因提示该亚型可能参与：

细胞维持

吞噬

细胞迁移

细胞黏附

GTPase活性调控

PICALM亚型

主要表现为：

PICALM高表达

ELMO1高表达

提示其可能参与免疫反应调控。

总体而言，稳态型小胶质细胞是所有髓系细胞中比例最大的群体。

它们表达经典的小胶质细胞marker，例如：

P2RY12

CX3CR1

6. Adaptive：适应型小胶质细胞

发现了7种特殊的适应型小胶质细胞亚型。

这些细胞能够针对不同的神经微环境刺激（neuro-environmental cues）产生特异性的适应性反应。

总体来看，这些适应型小胶质细胞具有共同的功能特征：

抗原加工和抗原呈递增强

并且促进：

MHC蛋白复合物的组装

具体包括以下亚型。

CCL3亚型

主要表现为趋化相关基因上调，尤其是炎症因子：

CCL3

CCL4

提示其具有较明显的炎症/趋化功能。

IFI44L亚型

富集干扰素诱导基因，包括：

提示其可能参与抗病毒先天免疫反应。

AIF1、HIF1A和HIST亚型

这三个亚型共享一个与：

免疫球蛋白介导的免疫反应

相关的共同基因程序。

TMEM163亚型

主要表现为：

MHC II介导的抗原加工和抗原呈递相关基因程序增强。

HSPA1A亚型

富集与未折叠蛋白适应性反应（adaptive response to unfolded protein）相关的基因。

其主要特征包括：

并且可能参与AD神经病理过程。

7. GPNMB：AD相关小胶质细胞（ADAM）

鉴定出一个名为：

GPNMB的髓系细胞亚型。

这种细胞主要存在于AD个体中。

因此将其归入：

即AD相关小胶质细胞。

GPNMB细胞具有较高表达的：

功能富集分析进一步表明：

8. MKI67：增殖型小胶质细胞

还发现了一个增殖型细胞群：

该细胞群高度富集细胞周期相关基因，例如：

说明该群体具有明显的：

9. ERN1：ex vivo激活型相关细胞

还发现了一个：

该亚型特异性表达：

其表达模式与之前报道的ex vivo activated microglia（exAM）较为相似。

也就是说，这一细胞状态可能部分反映了：

细胞从脑组织中分离出来后受到操作/离体环境刺激而产生的激活状态。

10. CD163：血管周围巨噬细胞（PVM）

除了小胶质细胞亚型之外，研究者还鉴定出了一个明确的：

该细胞表达一组典型的PVM marker，尤其包括：

CD163亚型显著富集与内吞作用（endocytosis）相关的基因。

这表明PVM具有较强的：

11. GPNMB小胶质细胞与PVM如何区分？

值得注意的是，ADAM和PVM在转录组上具有一定相似性。

但是通过进一步富集：

发现：

因此，GPNMB并不是简单地代表PVM，而是属于一个真正的AD相关小胶质细胞状态。

12. AD遗传风险与不同髓系细胞亚型

进一步使用：

scDRS（single-cell Disease Risk Score）

在单细胞水平估算不同遗传性疾病风险与髓系细胞亚型之间的关联。

除了AD之外，还分析了其他脑部疾病，包括：

FreshMG和PsychAD两个队列中，各疾病的多基因风险评分（polygenic scores）具有高度可重复性。

其中：

13. 哪些细胞亚型与AD遗传风险相关？

对FreshMG和PsychAD进行meta-analysis后发现：

9种髓系细胞亚型与遗传性AD风险显著相关。

这是所有研究脑部疾病中数量最多的。

之后依次为：

特别值得注意的是：

这进一步说明GPNMB细胞可能处于一种具有广泛免疫/疾病相关特征的特殊状态。

14. 最终验证：建立人类髓系细胞参考分类体系

为了证明这套分类体系可以作为：

人类髓系细胞参考taxonomy（reference human myeloid taxonomy）

进一步在多个独立数据集中验证了全部13种细胞亚型。

验证范围包括：

最终发现：

无论组织来源还是测序/检测技术如何变化，这13种髓系细胞亚型均具有较好的可重复性。

因此，这项研究建立了一套相对稳定的人类髓系细胞分类框架，为后续研究衰老、AD病理、遗传风险以及TREM2–MITF–GPNMB机制奠定了基础。

结果2、人类髓系细胞亚型在衰老和AD中的组成变化

在确定了13种人类脑髓系细胞亚型后，进一步分析这些亚型在正常衰老和AD进展过程中比例如何变化。

1. 正常衰老导致髓系细胞组成发生变化

在没有痴呆和明显神经病理改变的健康老年人中分析发现：

这一结果在其他已发表的人类小胶质细胞snRNA-seq数据中也得到了验证。

此外，男性和女性之间的髓系细胞亚型组成没有显著差异。

2. AD进展进一步改变髓系细胞组成

研究者进一步分析≥40岁的供体：

无论使用哪一种AD严重程度指标：

均观察到了明显的髓系细胞亚型组成变化。

其中最重要的变化包括：

其中CECR2和PICALM呈现与正常衰老类似的相反变化。

值得注意的是：

AD相关变化在Braak stage 3之后明显加剧。

说明髓系细胞组成变化可能在AD病理发展到一定阶段后进一步加速。

结果3、人类髓系细胞在衰老和AD过程中转录调控的变化

衰老相关的转录变化：

基因水平：正常衰老过程中，MS4A6A 基因表达增加，该基因与神经退行性过程有关。

细胞功能：稳态小胶质细胞（CECR2, PICALM）的衰老相关变化富集在细胞骨架组织和粘附/迁移通路。而PVM（CD163）和ADAM（GPNMB）亚型则更多地与炎症反应上调相关，表明衰老伴随炎症加剧。

AD相关的转录变化：

关键基因：发现一组在AD各表型中均上调的基因，如 PTPRG、DPYD、IL15。

组成变化验证：通过对比独立批量测序数据，证实了AD状态下，PICALM、CD163、GPNMB等亚型特征与AD病例高度相关，而CECR2等亚型则与对照更相关，重现了单细胞水平观察到的AD相关细胞组成变化。

疾病进程拟时间分析：

构建了基于Braak分期的“拟时间”轨迹来模拟疾病进展。

发现 PICALM 亚型与疾病的晚期阶段相关，而CECR2与早期相关。

关键的细胞组成和转录变化拐点出现在 Braak 3期，提示该阶段是AD进展的关键节点。

上游转录调控因子的发现（核心发现）：

通过构建基因调控网络（GRNs），筛选出与AD风险基因显著相关的转录因子。

确定了三个关键的调控因子（Regulons）：

这三个转录因子在ADAM（特别是GPNMB亚型）中协同作用，调控包括吞噬作用、细胞因子产生等关键功能。

机制验证与通路解析（实验验证）：

核心问题：MITF和GPNMB如何影响AD病理？

实验模型：在人小胶质细胞系中使用CRISPR激活技术，过表达MITF或GPNMB。

关键结果：

过表达 MITF 或 GPNMB 均能增强对 Aβ淀粉样蛋白和凋亡神经元的吞噬作用。

MITF的促吞噬效果强于GPNMB，但在面对“髓鞘”底物时，两者均无效，显示底物特异性。

使用抑制剂阻断MITF通路后，GPNMB过表达带来的促吞噬效应被取消，表明GPNMB的作用依赖于上游的MITF信号。

体内验证：在AD小鼠模型（5xFAD）中，MITF调控活性确实升高，而这种升高依赖于TREM2基因。

总结：

这项研究不仅描绘了衰老和AD进程中髓系细胞的转录组变化图谱，更深入地揭示了MITF 作为一个核心上游调控因子，通过调控包括 GPNMB 在内的下游靶基因，以底物特异性的方式影响小胶质细胞的吞噬功能，从而参与AD的发病和进展。这为理解AD的细胞和分子机制提供了新的视角，并可能为药物开发提供新的靶点（如MITF通路）

结果4、影响ADAM的非细胞自主机制

细胞间通讯（CCI）网络分析：

方法：使用LIANA工具，基于配体-受体相互作用，分析不同AD阶段髓系细胞间的通讯变化。

关键发现：

在AD中，APOE-SORL1 和 APOE-TREM2 这两对相互作用的强度显著增加，被确定为最重要的AD相关CCI。

GPNMB亚型是AD中上调CCI网络的核心“接收”节点，特别是接收来自APOE-TREM2的信号。

与GPNMB相关的CCI通路富集在脂质代谢和蛋白水解调节，这些过程与AD病理密切相关。

TREM2对GPNMB亚型的关键调控作用：

人类遗传证据：携带高风险 TREM2 基因变异（如R47H）的个体，其GPNMB表达水平更低，并且在AD进展过程中，GPNMB亚型的细胞比例并未扩增。这提示GPNMB亚型的出现和功能依赖于完整的TREM2信号。

小鼠模型验证：在AD小鼠模型（5xFAD）中，GPNMB亚型比例增加，但在 Trem2基因敲除的5xFAD小鼠中，这种增加现象消失，进一步证实了TREM2的必要性。

功能验证与机制解析（实验部分）：

细胞模型：使用TREM2基因敲除（杂合/纯合）的人诱导多能干细胞（iPSC）衍生小胶质细胞。

关键结果：

TREM2缺失导致 GPNMB 和 MITF 的mRNA表达下降约50%。

TREM2缺失显著降低了细胞对 Aβ、髓鞘和突触蛋白的吞噬能力。

抑制MITF通路同样会降低Aβ吞噬，表明 MITF 是TREM2下游的关键效应分子。

直接证据：通过流式细胞术分选出吞噬能力高和低的小胶质细胞群体，发现高吞噬活性细胞中GPNMB的蛋白和mRNA水平均显著更高，直接将GPNMB表达与吞噬功能联系起来。

核心结论总结：

这项研究描绘了一条清晰的AD相关分子通路：

AD病理 → TREM2信号激活 → 上调MITF转录因子 → 促进GPNMB表达 → 增强小胶质细胞对Aβ等底物的特异性吞噬 → 试图清除病理蛋白

其中，TREM2 是启动该通路的关键受体，GPNMB 是执行吞噬功能的关键效应分子，而GPNMB亚型是这一过程的主要细胞载体。该通路具有底物特异性（对Aβ和凋亡神经元有效，对髓鞘无效）。这为理解AD中小胶质细胞的功能失调提供了机制层面的解释，并提示TREM2-MITF-GPNMB轴可能是潜在的干预靶点。

生活很好，有你更好。