课前准备--空间多组学免疫衰老图谱揭示人类淋巴结中生发中心B细胞功能障碍

作者，Evil Genius

很多课题组找团队做项目，但是大家要知道，科研是要试错的，试错的成本也是课题组来承担的，而且本身处于完全被动的状态，非常不明智；不过随着接触的深入，也慢慢理解了课题组现状，很多课题组对生信分析不重视，或者认为自动跑流程、用公司的云平台就可以了，导致一直未能培养出一个真正懂技能的人，恶性循环一直这么下去，分析的主动权自然拱手让人了，等到真正要分析的时候，各种嫌弃公司的费用贵，其实很多的费用都用在试错上了，这个过程躲不过去的，要么有人，要么有钱，最好是有钱又有人。

之前很多同事想回家，只有科研助理岗位，无数的例子都在告诉我们，对于个人而言，真正的科研工作必须要有编制支撑的，一篇文章短则2年，长则无期，没有编制来稳定生活，转行是必然。

今日参考文章

知识积累

免疫衰老是老年人易感染、疫苗效果差及慢性炎症高发的重要原因。传统上，细胞衰老被视为由DNA损伤等压力引发的细胞周期停滞状态，但衰老的免疫细胞常呈现功能改变并分泌促炎因子（类似SASP现象），这会破坏组织稳态，加剧衰老相关的慢性低度炎症。

目前，对人类组织中衰老免疫细胞的具体类型、状态和组织分布仍缺乏深入了解。利用多种空间多组学技术（CODEX、DBiT-seq、空间表观组、CosMx、质谱蛋白组和代谢成像），系统分析了51名不同年龄段（18~100岁）供者的淋巴结样本。

衰老细胞增多且位置迁移：随年龄增长，表达p16、p21、HMGB1和γ-H2AX的衰老样细胞数量增加，并且空间分布从滤泡外区域向套区和生发中心移动。

B细胞是衰老“热点”：记忆B细胞、初始B细胞和生发中心B细胞均出现衰老特征的局部克隆样富集。

分子调控机制：空间转录组和表观组揭示，NF-κB、AP-1、KLF等转录因子参与调控衰老程序，且衰老相关基因（CDKN1A、CDKN2A）及SASP基因的染色质可及性增加。

代谢改变：衰老B细胞的脂质/蛋白比值发生改变，提示存在代谢适应性变化。

结果1、构建人类淋巴结多模态图谱的方法

样本来源与分组

共65名供者（41男，24女），108份样本（完整淋巴结或穿刺活检组织）。

分为三组：<50岁（26例，中位32岁）、50–69岁（15例，中位56岁）、≥70岁（10例，中位75岁）。

所有组织经病理学确认组织学正常。

组织类型与检测平台

同时使用新鲜冷冻（FF） 和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE） 组织。

FF样本：用于空间转录组学（DBiT）、空间ATAC-seq（染色质可及性）、质谱蛋白质组学。

FFPE样本：用于CODEX（多重免疫荧光）、CosMx空间分子成像、Patho-DBiT-seq、SRS代谢成像。

连续切片至不同类型载玻片以保证各平台兼容性。

数据整合与参考图谱

整合转录组、表观组、蛋白质组数据，构建空间多组学细胞衰老图谱。

并行整合公开scRNA-seq数据库（Tabula Sapiens + SLO Atlas），构建含约51万个单细胞转录组的参考图谱。

衰老样细胞鉴定

使用四种标志物（p16、p21、HMGB1、γ-H2AX）通过CODEX原位鉴定衰老样细胞（SnCs）。

最终数据规模

覆盖56名个体，超过2000万个单细胞的空间数据。

具体包括：CODEX分析99份（18个完整淋巴结 + 81个组织芯）、DBiT空间转录组11份、空间ATAC-seq 9份。

从中挑选1–2份高价值样本进行CosMx、质谱蛋白质组学和SRS深入分析。

研究目标

高分辨率解析衰老过程中SnC的丰度、空间分布及微环境。

探究SASP、DNA损伤反应（DDR）、炎症衰老（inflammaging）、免疫衰老通路及其与代谢和表观遗传机制的关联。

结果2、人类淋巴组织单细胞转录组参考图谱

数据来源与规模

PBMC数据：25名健康供者（23–100岁），约510,000个细胞，14种免疫亚型。

SLO数据：来自Tabula Sapiens数据库的人类次级淋巴器官scRNA-seq数据。

整合后共解析出34种细胞类型：11种B细胞、4种DC、10种T细胞，以及NK、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞等。

年龄分组

PBMC：第1组（<50岁）、第2组（50–70岁）、第3组（>70岁）。

SLO：a组（<50岁）、B组（50–69岁）。

衰老特征随年龄变化

第3组（≥70岁）的细胞周期阻滞评分、炎症/SASP评分、SenMayo评分均显著升高。

p21（CDKN1A）和p16（CDKN2A）在年长组中表达显著上调，H2AFX和HMGB1轻度升高。

关键通路变化

年长者富集：TNF-α/NF-κB信号、炎症反应、p53信号、未折叠蛋白反应、活性氧、凋亡。

年轻人富集：E2F靶基因、G2M检查点、有丝分裂纺锤体、DNA修复（增殖相关）。

SenMayo⁺细胞分布（衰老富集细胞）

PBMC中：主要集中在CD4⁺/CD8⁺ T细胞、NK CD56高表达细胞、经典单核细胞。

SLO中：富集于记忆B细胞、初始B细胞、浆细胞、T_FH、活化CD4⁺/CD8⁺ T细胞。

基质与微环境也参与衰老

MALAT1⁺基质细胞随年龄SenMayo活性增加。

滤泡树突状细胞（FDCs）、血管平滑肌细胞（VSMCs）、内皮细胞也表现出衰老相关贡献，提示组织微环境广泛重塑。

髓系和增殖细胞的变化

单核细胞和DCs在≥70岁组中SenMayo和SASP富集最强，DCs的细胞周期阻滞尤为明显。

cycling-like B细胞在所有年龄组中DNA损伤信号均很高。

结论

免疫衰老在70岁左右才变得显著，此前（<50岁和50–70岁）变化相对温和。

PBMC衰老主要表现为炎症和T/NK细胞变化；SLO中B细胞衰老样状态与体液免疫损伤相关，是本研究重点关注的领域。

结果3、不同年龄组中SenMayo富集细胞的功能异质性

SenMayo高表达细胞的聚类与功能

选取淋巴组织中SenMayo富集前10%的细胞，分为多个聚类。

聚类2（Th1/Th17样T细胞）：高表达SASP因子（CXCL3、CXCL2、CXCR2、IL-10、IL-1β）。

聚类4和5（血管内皮细胞、成纤维细胞）：高表达GDF15和IGFBP家族成员（IGFBP2–5），提示生长和凋亡信号改变。

聚类3和4（高表达ICAM1）：可能促进免疫细胞募集和黏附，参与组织衰老相关炎症。

年龄>50岁供者的细胞通讯网络

SASP富集细胞构成高度互联的信号枢纽，协调免疫逃逸、白细胞募集和检查点调控。

LGALS9-CD45信号（来自迁移性DC）→ 抑制T/NK细胞活化。

CLEC2C-KLRB1相互作用（NK和CD161⁺ T细胞）→ 维持先天免疫监视平衡。

CD22-PTPRC（CD45）轴（B细胞中显著）→ 抑制B细胞受体信号，调控炎症环境中的B细胞应答。

APP-CD74信号→ 促进NF-κB激活（内皮/基质活化）。

ICAM1/2-ITGAL/ITGB2（LFA-1）广泛网络→ 促进促炎细胞因子产生。

年龄相关的通讯通路转变

<50岁：CD99信号显著富集；SASP细胞通过ICAM途径影响TIM3⁺ DC和GC T_FH细胞。

>50岁：SEMA4通路选择性富集（促进B细胞和DC活化）；ICAM网络在巨噬细胞、单核细胞和Tregs之间连接增强，提示向免疫抑制和“炎症衰老”转变。

年龄相关B细胞（ABCs）与衰老样B细胞亚型

T-bet⁺ ABCs是衰老免疫改变的标志，在年长者中SenMayo基因上调（尤其cycling-like B细胞和浆细胞）。

cycling-like B细胞和生发中心暗区B细胞（B_GC_DZ） 高表达CDKN2A和H2AFX，是受衰老样程序影响的主要群体，与经典ABCs不同。

核心结论

B系细胞（初始、记忆、cycling-like、浆细胞）承载与衰老相关的最大的转录负荷。

免疫衰老不严格等同于细胞周期停滞，而是以年龄相关的免疫功能下降为特征，由衰老相关程序部分驱动；增殖性细胞的衰老状态仍存在学术争议。

结果4、高多重蛋白质成像用于绘制区域和细胞类型特异性细胞衰老图谱

检测方法与数据整合

使用53重CODEX对完整淋巴结切片和组织微阵列进行成像，检测34种细胞类型及四种衰老标志物（p16、p21、HMGB1、γ-H2AX）。

通过MaxFuse将单细胞转录组数据与CODEX成像数据整合，实现细胞类型注释的转移。

衰老标志物随年龄的变化

p16和p21共表达随年龄增加。

50–70岁：标志物主要在套区；86岁：向滤泡内迁移。

单阳性、双阳性、三阳性、四阳性细胞在年长供者中均显著增加。

四阳性细胞几乎仅见于>70岁组。

空间分布模式的年龄相关转变

年轻（18–50岁）：p16/p21阳性细胞广泛弥散分布于滤泡间区和副皮质区。

50岁：信号收缩至生发中心和套区。

>70岁：信号集中于滤泡核心/生发中心，周围接近背景——呈现向心性聚集。

衰老主要局限于B细胞区室

p16⁺/p21⁺双阳性细胞在滤泡内占局部细胞池的3%–5%，主要集中于B系亚群：记忆B细胞、初始B细胞、生发中心暗区/明区B细胞、活化B细胞、干扰素反应性B细胞。

滤泡外双阳性密度急剧下降 → 免疫衰老以滤泡为中心，主要影响抗原经历过的和增殖性B细胞。

衰老标志物在B细胞亚型中的表达

HMGB1表达最高（但特异性较低）→ γ-H2AX → p21 → p16。

三阳性和四阳性表型主要局限于B_memory和B_naive细胞，提示这些亚群携带最复杂的衰老特征。

核心结论

衰老样细胞随年龄从弥散分布转变为生发中心的集中热点，即衰老微环境的向心性重塑。

这种空间重组主要涉及抗原经历过的和增殖性B细胞亚群，提示衰老样程序可能增加这些细胞在感染或疫苗接种应答中的功能障碍风险。

血管和基质细胞衰老已有报道，研究首次系统揭示滤泡B细胞是淋巴结免疫衰老的关键靶细胞。

结果5、细胞衰老的空间蛋白质组学和代谢组学表征

单细胞蛋白质组学（p16⁺ vs p16⁻细胞）

样本：78岁供者，激光捕获显微切割滤泡内单个p16⁺细胞，nanoPOTS蛋白质组学（每细胞~740个蛋白质组）。

鉴定出150个差异丰度蛋白（FDR<0.05）。

p16⁺细胞中显著下调的蛋白

DKC1（端粒酶复合物核心组分）→ 端粒维持受损（log₂FC≈3.2，下调最显著）。

EIF3K、RPL3/RPLP1B、RPRD2 → 翻译起始和转录调控抑制。

SFXN1 → 线粒体丝氨酸转运和单碳代谢受损。

p16⁺细胞中显著上调的蛋白

RAB1B → 内质网应激和自噬体形成。

MARC2 → 线粒体氧化还原调控酶。

主要改变的信号通路

端粒酶介导的端粒延伸（最显著）。

CXCR4信号通路、Lck/Fyn介导的TCR启动通路。

总体提示：端粒不稳定性 + 应激适应 + 免疫受体信号重编程。

代谢成像（SRS + CODEX共配准）

脂质/蛋白比值：p16⁺和p21⁺的生发中心B细胞显著升高；内皮细胞仅轻度升高，但γ-H2AX⁺内皮细胞显著升高。

脂质饱和度（CH₂/CH₃） ：p16⁺和γ-H2AX⁺细胞中普遍增加，γ-H2AX⁺细胞（主要位于滤泡周围/副皮质区）升高最显著。

氧化还原比值：p16⁺和γ-H2AX⁺群体中下降（更氧化状态）；p21⁺细胞无下降（因其多位于滤泡间区，细胞仍高增殖，维持更还原状态）。

结论

衰老标志物表达具有高度细胞类型特异性和标志物依赖性。

记忆B细胞是主要衰老群体：占p16⁺细胞的~75%，γ-H2AX⁺细胞的~60%，可能是晚期或不可逆衰老的储存库。

不同衰老标志物捕获不同的衰老亚型（senotypes） 及衰老阶段、轨迹或机制，B细胞在衰老连续谱中占据不同位置。

结果6、空间全转录组测序用于细胞衰老表征

细胞类型分辨的衰老标志物变化

MaxFuse整合空间转录组与单细胞参考数据集，实现细胞类型注释。

随年龄增加，CDKN2A(p16)、CDKN1A(p21)、H2AX、HMGB1在以下细胞中表达升高：

B细胞：初始、浆细胞、生发中心B细胞

非免疫细胞：血管平滑肌细胞、内皮细胞

免疫细胞：滤泡辅助T细胞(T_FH)、树突状细胞

SenMayo特征的年龄轨迹

60岁后衰老程序显著升高，70岁以上几乎所有细胞类型Z评分急剧增加。

B_GC_LZ、B_naive、B_plasma、cycling-like B细胞的SenMayo富集最显著。

DDR、细胞周期阻滞、SASP等通路变异较大（不如SenMayo一致）。

基因表达轨迹聚类（衰老过程中的动态变化）

聚类0：稳定至下降 → 补体激活、翻译程序（肽链延伸、病毒mRNA翻译）

聚类1：早期急剧下降后平台期 → RNA加工和剪接（mRNA成熟减少）

聚类2：早期轻度下降，晚年恢复 → 能量代谢、前体代谢物生成

聚类3：晚年选择性上调 → 中性粒细胞脱颗粒、铁死亡、细胞运动、伤口反应

总体：代谢适应 + 炎症/组织重塑转录程序的出现。

>70岁滤泡B细胞的通路变化

86岁淋巴结：p16/p21双阳性 vs 双阴性 B细胞：

双阳性（衰老）上调：SAMHD1、BCLAF1、MED13L、FOS（细胞周期控制、应激、免疫信号）

双阳性（衰老）下调：IGHG1、IGLC3、IGHM、ARPC5（抗体产生↓、细胞骨架活性↓）

富集通路：NF-κB信号（富集倍数最高）、凋亡通路 ↑

CosMx单细胞验证

6,000基因panel识别p16/p21阳性细胞，显示衰老标志物在滤泡结构内特异性富集。

STalign将CosMx与CODEX对齐，基于p16/p21蛋白谱识别衰老细胞。

衰老邻近vs远处B细胞：CCL21、COX1、COX2等SASP相关基因差异表达。

结论

空间转录组学揭示了淋巴结衰老过程中细胞类型特异性的衰老程序变化。

B细胞（尤其滤泡内）是衰老的核心靶细胞，表现为抗体产生下降、NF-κB/凋亡通路激活、SASP基因上调。

基因表达轨迹分析提示代谢适应和炎症/铁死亡/组织重塑是淋巴结衰老的重要特征。

结果7、空间表观基因组测序用于细胞衰老表征

方法与数据整合

对9份淋巴结组织（20-86岁）进行空间ATAC-seq（染色质可及性分析）。

与单细胞参考图谱整合，实现细胞类型分辨的表观基因组分析。

空间定位：PAX5可及性→B细胞区，CD3D→T细胞区。

衰老标志物基因的染色质可及性变化

CDKN1A、CDKN2A、H2AFX、HMGB1的基因活性评分在B细胞和活化T细胞区域富集，随年龄增加。

年老样本中CDKN2A/B、CDKN1A、H2AFX位点ATAC峰值更高更宽（可及性增加）。

预测到CDKN2A相关的启动子-增强子动态互作（FDR<0.05）。

转录因子motif富集（细胞类型特异性）

成纤维细胞、B细胞滤泡、内皮细胞：富集HOXA7、NFIX、SMAD4、NFE2L1、MEIS1（发育/应激程序）。

活化T细胞：富集SPIB、EGR3（免疫激活/SASP信号）。

调控衰老基因的顶级motif包括：FOS:JUN、FOSL2:JUN、FOS:JUND（AP-1复合物）→ 应激/炎症/衰老。

年龄组间染色质可及性对比

>70岁 vs <50岁的差异可及基因

年老增加：PKHD1、CLVS1、KCNH7、OXR1、KCNK2、MSR1（氧化应激、组织重塑、炎症）。

年老减少：TUBA4A、SCAMP3、ABCG3、FAM72B（细胞骨架、膜运输、细胞更新）。

衰老相关通路富集（>70岁可及性增加基因）

DNA损伤/端粒应激诱导衰老、TP53调控DNA修复、细胞周期检查点、氧化应激、NF-κB信号、SASP转录程序。

motif富集年龄差异

>70岁增加：KLF家族（KLF1/3/5/6）、NFY、SP1、SP2、HOXA9（调控衰老、细胞周期、炎症、耗竭）。

<50岁富集：MEF2A、EAR2、COUP-TFII、THRA、RAR、LXRE（细胞生长、代谢、抗炎、脂质处理）。

B细胞是衰老表观重编程的核心靶标

cycling-like B细胞：H2AFX、HMGB1高表达。

浆细胞：CDKN1A、CDKN2A高表达。

T细胞衰老相关活性相对较低（Z评分低或负）。

结论

淋巴结衰老伴随染色质可及性的全局重塑：促衰老/炎症位点打开，基因组维护/细胞更新位点关闭。

KLF和AP-1家族是调控衰老相关染色质开放的关键转录因子。

表观基因组变化为衰老的早期事件提供了空间分辨证据，B细胞（尤其cycling-like和浆细胞）是受影响最显著的群体。

生活很好，有你更好。