课前准备--通过多模态高密度采样解析成人心脏，揭示组织特异性细胞状态与疾病相关变异

作者，Evil Genius

我们写够300万字，就停一停，目前295万了。

今天我们来汇总一些visium、visium HD、xenium的分析使用场景。

知识积累

成人心脏由解剖学特化区域组成，各区域局部细胞构成决定其功能及疾病易感性。

许多重大心血管疾病发生于特定解剖结构：

瓣膜疾病 → 瓣叶

心房颤动 → 肺静脉

动脉粥样硬化 → 冠状动脉

多模态图谱的构建

对成人心脏 28个解剖区域 进行系统性分析。

整合多种技术手段：

单细胞核RNA测序（snRNA-seq）—— 基因表达谱

单细胞核ATAC测序（snATAC-seq）—— 染色质可及性（调控活性）

空间转录组学 —— 空间位置信息

互补成像模态

瓣膜：成纤维细胞-巨噬细胞微环境

鉴定出一种瓣膜成纤维细胞–巨噬细胞微环境；

该微环境极化分布于非纤维层表面，并随年龄增长而扩大；

与主动脉瓣狭窄易感性相关；

主动脉瓣狭窄的遗传风险富集于该微环境的炎症调控程序中。

肺静脉：PITX2⁺ 心肌袖细胞

定义了一种区域限制性的心肌细胞群体 —— PITX2⁺ 心肌袖细胞；

该细胞类型与4q25心房颤动遗传变异位点相关联；

该变异位点位于该细胞类型特异的开放染色质区域内。

冠状动脉：RUNX1⁺ 合成型平滑肌层

在冠状动脉内膜下层发现一层以 RUNX1 为标志的合成型平滑肌细胞；

该结构为弥漫性内膜增厚提供分子身份 —— 这是健康血管壁的固有特征，也是动脉粥样硬化的基质；

功能实验（人平滑肌细胞扰动）证明：

RUNX1促进细胞周期进入；

RUNX1抑制炎性细胞因子基因表达。

遗传调控机制解析

等位基因特异性可及性分析

结合等位基因特异性染色质可及性，识别不同等位基因对调控区域开放程度的影响。

深度学习序列–功能模型

微调深度学习模型，从DNA序列预测调控活性；

鉴定出心房颤动、冠状动脉疾病、钙化性主动脉瓣狭窄的GWAS位点中的细胞类型特异性调控效应。

关键案例：ATP13A3 变异

发现一个变异位点，在瓣膜成纤维细胞中对多胺转运蛋白 ATP13A3 的调控效应方向，与缺乏瓣膜细胞的批量组织eQTL数据中观察到的效应方向相反。

细胞类型特异性对于解读遗传变异功能至关重要，批量组织数据可能掩盖甚至歪曲真实效应。

结果1、疾病相关心脏区域的多模态分析可解析区域富集的细胞状态和微环境

研究设计与样本

数据生成与技术平台

细胞类型注释方法（核心分析流程）

1. 批次效应校正

考虑协变量：供体身份、输入类型（细胞/细胞核）、10x化学版本

2. 注释模型

使用 inVAE（条件不变变分自编码器）构建潜在空间

以解剖学“tissue”作为不变关键变量（invariant key），使批次效应被消除的同时保留生物学差异

3. 稳健性验证

在独立的 scVI 潜在空间中，用交叉验证k近邻分类评估标签可恢复性

结果：中位准确率83.5% → 注释结果在不同整合框架下稳健

4. 注释产出

18种细胞类型、65种细胞状态，分层分类体系

与先前图谱比对：所有主要细胞类型均重现

新发现的两个分类细化：

Mural Cell → 分化为 Pericyte 和 Smooth Muscle Cell

Endocardial Cells 独立于 Endothelial Cells 聚类

空间数据注释与微环境鉴定方法

Visium数据处理（无单细胞分辨率）

使用 cell2location 解卷积 → 估计每个spot的细胞状态丰度

再经 inVAE 整合 → 无监督聚类

结果：鉴定出 8个 空间组织微环境

Xenium数据处理（单细胞分辨率）

使用 Baysor 进行细胞分割

使用 CellTypist 将标签从snRNA-seq数据转移至空间细胞

跨区域整合与聚类

基于 NicheCompass 嵌入进行整合和聚类

结果：鉴定出 17个 具有不同细胞组成和区域富集的微环境

多平台对比

神经微环境：Xenium和Visium均一致识别

心肌和平滑肌：Xenium解析出更多亚型（单细胞分辨率优势）

以肺静脉为例展示四种空间模态（H&E、Visium HD、Visium、Xenium）的互补视图

区域特异性分析方法

方法1：方差分解

使用线性模型对样本水平细胞类型比例进行方差分解

纳入协变量：解剖区域、供体相关因素（年龄、性别）、技术协变量

结果：解剖区域是大多数细胞状态变异的主要来源

区域特异性最显著的群体：Valve Fibroblasts、心房心肌细胞、平滑肌细胞、传导系统

方法2：基尼系数

计算每种细胞类型/状态跨区域平均丰度的基尼系数

目的：量化区域限制性程度

结果：清晰梯度——

高区域限制：瓣膜成纤维细胞、传导系统、平滑肌亚型、心房心肌细胞

低区域限制（广泛分布）：成纤维细胞、免疫细胞

结果2、心脏瓣膜中存在一个与疾病易感性相关的免疫活性基质微环境

瓣膜成纤维细胞的鉴定与分群

神经成纤维细胞的捕获

瓣膜非纤维层表面的结缔组织-免疫微环境

分析方法：

Visium空间转录组学（主动脉瓣和二尖瓣叶）

无监督聚类鉴定空间组织区域

沿跨瓣膜空间轴（非纤维层表面 → 纤维层）分析微环境丰度

关键发现：

鉴定出8个空间组织区域，包括瓣膜纤维层、平滑肌、脂肪和结缔组织-免疫微环境

结缔组织-免疫微环境（含Valve Fibroblasts Immune + 巨噬细胞）优先定位于非纤维层表面（血流暴露侧）

蛋白水平验证（RareCyte免疫荧光）：非纤维层表面CD163⁺巨噬细胞比例更高（p=0.062）

平滑肌细胞位于瓣膜表面附近层次（此前报道见于狭窄主动脉瓣钙化区）

瓣膜免疫微环境中的细胞通讯

→ 瓣膜成纤维细胞协调局部补体信号，同时通过ANXA1/FPR抑制巨噬细胞炎症 → 双向调控

年龄相关的扩增和炎症激活

分析方法：

差异丰度分析（供体年龄范围20-74岁）

邻域富集分析 + 通路富集分析

遗传风险汇聚于Valve Fibroblasts Immune

分析方法：

SCENIC+ → 构建细胞状态特异性基因调控网络

SNP2CELL → 整合主动脉瓣狭窄的GWAS汇总统计数据

关键发现：

疾病相关遗传信号优先富集于Valve Fibroblasts Immune的调控网络

汇聚的转录因子程序：NF-κB、IRF、AP-1信号（炎症和应激反应核心）

结论：年龄扩增的Valve Fibroblasts Immune（位于空间明确的免疫微环境中）= 遗传驱动性瓣膜疾病的候选介质

结果3、肺静脉心肌袖细胞代表一种特化的心肌细胞群体

心肌细胞的全面分群

心肌袖细胞——肺静脉新型群体

q25房颤位点的因果变异解析

分析方法：

将房颤GWAS精细定位的可信集SNP与细胞状态分辨的开放染色质区域（ATAC-seq）交集

峰-基因连锁分析（peak-to-gene linkage）

SNP2CELL网络传播分析

增强子驱动的基因调控网络（SCENIC+）富集分析

肺静脉壁的空间组织结构

技术组合：Visium + Visium HD + Xenium（多层次分辨率）

平滑肌层的两个转录程序（Visium HD + NMF解析）：

心肌袖的细胞组成（Xenium单细胞分辨率）：

心肌袖并非单一细胞组成，包含三种主要状态：

心肌袖细胞（Myocardial Sleeve Cells）

毛细血管内皮细胞（Endothelial Cells Capillary）

左心房应激心肌细胞（Atrial Cardiomyocytes Left Stressed）

细胞间通讯：

心肌袖细胞 ↔ 左心房应激心肌细胞 + 毛细血管内皮细胞之间通过玻连蛋白信号相互作用

结果4、心脏动脉中血管平滑肌细胞的多样性

血管细胞类型全景

平滑肌细胞的分群

合成型 vs 收缩型的关键差异：

合成型：cycling细胞比例↑、NOTCH2↑ / NOTCH3↓

收缩型：NOTCH2↓ / NOTCH3↑

RUNX1 motif富集：Smooth Muscle Cells Coronary Artery在所有非造血细胞中RUNX1 motif可及性最高（chromVAR）

冠状动脉壁的空间组织

技术验证：Xenium + Visium + Visium HD（三重共配准）

同心圆结构（从内到外）：

管腔 ↓ 内皮层 ↓ 【内膜下层（Subintima）】 ← Smooth Muscle Cells Coronary Artery（合成型，>RUNX1⁺） ↓ = 弥漫性内膜增厚（DIT）的细胞身份 内弹性膜 ↓ 【中膜（Media）】 ← Smooth Muscle Cells Arterial（收缩型） ↓ 外膜

DIT（弥漫性内膜增厚）：

健康冠状动脉的固有特征

动脉粥样硬化的公认基质

本研究首次赋予其分子和细胞身份：RUNX1⁺合成型纤维肌细胞层

疾病对比：健康 vs 动脉粥样硬化血管中，SMC分布无显著差异 → 该群体是构成性特征，而非疾病继发

细胞间通讯（冠状动脉微环境）

分析方法：CellPhoneDB（平滑肌 ↔ 内皮）

主要信号轴：

RUNX1功能验证（体外扰动实验）

实验设计：

原代人平滑肌细胞

慢病毒过表达 + siRNA敲低 RUNX1

下游：单细胞RNA测序

关键结果：

剂量效应解析：

负反馈架构：

RUNX1是SMC Coronary Artery程序（模块6）的组成部分

RUNX1↑ → 驱动增殖 + 同时抑制该程序的炎性分支

核心结论链条

冠状动脉壁 ↓ 内膜下层（DIT）← 分子身份：SMC Coronary Artery（RUNX1⁺ 合成型纤维肌细胞） ↓ 健康冠状动脉的构成性特征（非疾病继发），随年龄累积 ↓ RUNX1驱动：① 增殖（阈值效应）+ ② 抑制炎症（剂量效应）= 负反馈 ↓

• BMP信号作为增殖的稳态制动
• HGF–MET信号连接SMC与内皮 ↓ 功能模型：该群体处于“增殖但炎症受抑”的稳态，可能具保护性 ↓ 待验证问题：RUNX1抑制丧失是否使该群体促发动脉粥样硬化？

结果5、基因型分析和利用Multiome数据的等位基因特异性可及性

等位基因特异性可及性分析框架

目的：鉴定通过细胞类型特异性调控机制发挥作用的GWAS变异

数据：

655个SNP（PIP > 0.4，涉及AF、CAD、CAVS三种性状）

26名供体（芯片基因分型15名 + 读段基因分型11名）

Multiome数据 → WASP重映射（去参考偏倚）→ UMI去重 → 等位基因计数 ↓ beta-binomial似然比检验（三个层次）： ① 供体水平（批量） ② 供体-细胞类型水平 ③ 供体-细胞状态水平

质量控制：

每个SNP-组对：≥4个杂合供体，每个≥10条读段

供体间一致性分数 ≥ 0.7

结果：

161个可检验的SNP-细胞类型对 → 93对显著（FDR < 0.15）

12个SNP仅在供体-细胞类型水平显著（供体水平不显著）→ 支持真正细胞类型特异性

深度学习模型微调与验证

模型：

微调策略：

使用细胞类型匹配数据进行微调（优于Tn5基线和不匹配模型）

AlphaGenome：线性探针模型（准确性媲美LoRA，成本更低）

性能验证（预测 vs 观察到的ASA）：

三个GWAS变异的机制解析

示例1：rs2979489（AF）

示例2：rs1706003（CAVS）——方向相反的关键案例

示例3：rs1886512（AF）

细胞类型对性状的整体贡献（AlphaGenome预测）

CardioSleuth平台

性质：AI驱动的代理交互式探索引擎

整合资源：

细胞状态特异性基因调控网络

GWAS分数传播

AlphaGenome变异效应预测（预计算）

外部知识库注释

功能：

支持基因、变异、转录因子的上下文感知解读

用户可交互式评估和整理引用

将图谱转化为细胞状态特异性疾病机制假设

多组学数据（Multiome） ↓ ASA分析（3个层次） + 深度学习模型（ChromBPNet/AlphaGenome微调） ↓ 【关键创新】整合观察到的ASA与模型预测，实现交叉验证 ↓ 三个GWAS位点机制解析： ① AF → RBPMS → 心房心肌细胞 ② CAVS → ATP13A3 → 瓣膜成纤维细胞（方向相反于GTEx） ③ AF → KLF12 → 心室心肌细胞（重构机制） ↓ CardioSleuth平台 → 开放、可交互的资源

最后来看看空转的分析方法

visium

visium HD

Xenium数据

空间通讯分析

xenium 5k

生活很好，有你更好。