     将肝细胞用于基础研究和再生医学需要对

决定肝细胞分化和成熟的遗传因素有全面的理解

。在类器官中进行单细胞CRISPR筛选，可以将

基因扰动与单细胞的平行转录组读数关联起来

提供了一种强有力的方法。然而，在数据分析中识别关键调控因子面临的一个

重大挑战是转录因子（TFs）表达水平低

，这使得由于单细胞测序中的噪声和丢失而难以准确估计。此外，通常与细胞命运转变相关的，不是转录因子的表达水平，而是转录级联中转录因子的活性变化。

基于类器官的单细胞 CRISPR 筛选并通过调控元分析（OSCAR）的方法

，该框架使用调控元活性作为读出，用于解析类器官中基因敲除的影响。在由成体干细胞衍生的肝脏类器官中，我们在 245 次与肝细胞形成转录调控相关的干扰下，对 80,576 个细胞的转录组进行了绘图。利用 OSCAR，我们

识别出了已知和新发现的正负调控因子

，其中 Fos 和 Ubr5 排名最高。进一步的单基因功能丧失实验表明，在小鼠和人类肝脏类器官中，

Fos 的缺失通过特异性上调肝脏代谢基因及途径促进肝细胞分化，而在小鼠肝脏中条件性敲除 Ubr5 会延缓肝细胞的成熟

     总的来说，我们提供了一个框架，以快速且系统的方式探索血统特异因子，并识别具有潜在临床应用的肝细胞决定因子。

关键词：肝细胞分化与成熟、类器官、单细胞CRISPR筛选、调控子

    在这里，我们建立了OSCAR，这是一种在类器官中使用调控网络变化作为读出进行单细胞CRISPR筛选的方法，并将其应用于识别肝细胞分化和成熟的调节因子。使用OSCAR，我们识别并根据它们

对肝细胞标志物表达的调控效应

，对促进或抑制这一过程的两类调节因子进行了排序。在排名靠前的调节因子中，c-Fos（活化蛋白-1，AP-1转录因子组分）在小鼠类器官（mICOs）和人类类器官（hICOs）中扰动时，均导致肝细胞分化和成熟加速；而Ubr5的缺失则产生相反的效果。总体而言，我们的研究展示了一种

基于类器官的单细胞CRISPR筛选方法，该方法具有可扩展性、可操作性，并且适用于识别细胞命运转变中的调控因子。

Establishment of an organoid‑based single‑cell CRISPR screen for hepatocyte lineage  regulators

建立基于类器官的肝细胞谱系调控因子单细胞CRISPR筛选

    为评估在三维类器官中进行单细胞CRISPR筛选的可行性，我们在小鼠ICOs（mICOs）中进行了概念验证CROP-seq筛选，从表达spCas9-EGFP的Rosa26位点小鼠肝脏中分离出（见图1a）。mICOs在扩容培养基（EM）中形成自组织的囊性结构，表达肝细胞谱系标记和导管标记。mICOs可在定义的分化培养基（DM）中转化为类似肝细胞的细胞，持续时间为~12天。为提升系统在类器内单细胞CRISPR筛选的可扩展性和操作性，我们将分化策略的持续时间从12天（DM_12）缩短为7天（DM_7），并比较两者之间的转录谱。与之前报告一致，两种策略均可诱导多种肝细胞标记蛋白（如Alb、Ttr、Cyp3a11、Apoa1、Mup20、Mrp2、Sult1a1和Aldh1a1）的表达，同时还能减少导管标记如Sox9和Spp1，表明胆管细胞向肝细胞的转移（附加文件1：图S1a）。转录谱的主成分分析（PCA）显示，DM_7样本与DM_12样本最为接近，表明两种策略在转录上的整体相似性（附加文件1：图S1b）。差异基因表达分析显示，DM_7组和DM_12组中，约80%的上调基因和下调基因在组之间得以保守（附加文件1：图S1c，附加文件2：表S1a、b）。几乎所有基因本体（GO）生物过程中，DM_7和DM_12组共享的上调基因富含的过程均与代谢相关，而与下调基因相关的富集过程则与细胞周期通路相关（附加文件1：图S1d和附加文件2：表S1c、d）。针对 DM_7 策略的转录组分析进行的基因集合富集分析（GSEA）识别出多种与代谢相关的过程，如视黄醇代谢、药物代谢，以及补体和凝血级联反应（附加文件 1: 图 S1e-h），提示 mICO 可分化为功能性类肝细胞。综合来看，上述结果表明 7 天的分化策略足以产生类肝细胞。对于试点筛选，我们设计了一个针对六个肝脏命运调控因子的sgRNA文库（每个基因三个sgRNA），即Hnf4α、Onecut1、Hdac3、Esrp2、Cebpd和Hmga2，以及4个非靶向对照（NTs），总共22个sgRNA（附加文件2：表S2）。这些sgRNA被单独克隆到经mCherry报告基因修饰的慢病毒CROP序列载体中。为了进行筛选，将mICOs用该CROP-Guide-mCherry gRNA文库产生的慢病毒进行转导，感染复数（MOI）为0.3，并在转导后第3天通过FACS富集基因组编辑的细胞（GFP /mCherry）（图1a、b）。在分选后第5天，GFP /mCherry双阳性mICOs被分裂，并分别进行EM进行扩增或DM进行为期7天的分化；两种细胞群体均使用10× Genomics scRNA-seq 3’ polyA引导平台进行捕获（图1a）。

   在基于表达基因数量、RNA计数和线粒体基因比例（附加文件 1: 图 S2a, b）的 scRNA-seq 质量控制以及 sgRNA 分配之后，我们在 EM 组获得了共计 8812 个细胞，在 DM 组获得了 11,234 个细胞（图 1c）。每组中超过 70% 的细胞至少分配到一个 sgRNA，约 50% 的细胞分配到了唯一的 sgRNA，表明低感染复数（MOI）（图 1c 和附加文件 1: 图 S2c）。为了消除干扰效应，我们在下游分析中排除了分配到多个 sgRNA 的任何细胞。具有唯一 sgRNA 分配的细胞经过归一化和缩放，进行聚类和通过统一流形近似与投影（UMAP）进行降维，可视化显示 EM 组和 DM 组细胞的明显分离（图 1d）。一组已知的肝细胞标记基因，例如 Alb、Ttr、Mup20、Apoa1、Sult1a1 和 Aldh1a1，在 DM 组的细胞中上调（图 1e），证实了分化诱导的响应。当我们根据 scMAGeCK 计算的前 20 个高变基因的影响对 sgRNA 进行聚类时，针对相同基因的 sgRNA 显示出类似的扰动效应（图 1f）。有趣的是，针对 Hdac3 的 sgRNA 产生的表达模式与针对 Hnf4α 的 sgRNA 相反，这与它们在肝细胞分化和代谢中的相反作用一致，尽管在这前 20 个高变基因中未检测到经典的肝细胞或胆管细胞标记（图 1f）。几个肝细胞或胆管细胞标记的提琴图进一步证实了 Hnf4α 基因敲除对胆管细胞向肝细胞分化的抑制作用（图 1g）。这些结果表明，mICO 中的单细胞转录组谱可以揭示肝细胞命运决定关键调控因子的扰动效应。

OSCAR for identifying novel modulators regulating hepatocyte differentiation  and maturation

用于识别调节肝细胞分化和成熟的新型调节因子的OSCAR

   接下来，我们将我们的筛选策略应用于通过比较小鼠肝脏E14.0的整体RNA-seq数据与成年小鼠肝脏数据，或挖掘先前报道的参与肝脏发育的调控因子而入围的候选调控基因的广泛基因集合。该文库包括236个针对79个基因的sgRNA（每个基因3个sgRNA，Hnf4α除外有5个sgRNA）以及10个非靶向控制（NTs），总计246个sgRNA（附加文件2：表S3）。与试点筛选类似，spCas9-EGFP mICO以每个sgRNA 2000个细胞的代表性被转入246个sgRNA的文库，因为只有一部分解离的mICO能够生成新的类器官。我们对80,576个细胞的转录组进行了测序，中位测序深度约为每个细胞50,000条reads。在将sgRNA分配到每个单独细胞并过滤掉低质量细胞后，我们获得了DM组30,217个细胞和EM组11,166个细胞具有唯一sgRNA分配，分别占各自组的50%以上，这与试点筛选中的百分比相似（图2a和附加文件1：图S3）。

   为了识别肝细胞分化和成熟中的调控因子，我们开发了一种计算分析流程（OSCAR），用于根据调控网络的变化评估干扰效应（图2a）。由于分化过程通常是由转录因子（TF）驱动的级联反应，我们

推测以转录因子为中心的共变基因模块的活性是我们筛选中最具生物学意义的读出指标。

在基因模块水平而非单基因水平评估转录变化也可以减少由单细胞表达数据的随机性产生的噪音。因此，我们通过使用SCENIC（图2a），结合基因共表达和转录因子-基因调控关系，从我们的筛选数据中新建地映射了此类转录因子“调控子”。总的来说，我们在OSCAR筛选中发现了244个其活性显著变化的调控子（附加文件2：表S4）。其中，150个调控单元与在小鼠胎肝发育过程中差异激活的282个调控单元共享主转录调控因子（图2b）。这些调控单元的主转录因子包括已知的肝细胞分化关键调控因子，如Hnf4α、Foxa2和Cebpα，以及在胆管细胞分化过程中被激活的转录因子，如Hnf1β、Sox4和Sox9。此外，从我们的数据中得出的前20个可变调控单元与分化和生物合成相关，包括多条脂质和葡萄糖代谢通路（附加文件1: 图S4和附加文件2: 表S5）。这些结果表明，肝类器官中的扰动能够诱导调控网络的变化，这些变化重现了体内肝细胞分化和成熟过程中的变化。

   为了评估我们的基于调控子分析的方法，我们首先通过在数据中下采样细胞来比较调控子活性与基因表达的稳健性。我们发现，只需要40–50个细胞就可以可靠地检测到调控子活性的变化，而稳健地识别基因表达变化则需要120–150个细胞（附加文件1：图S5）。这些结果表明，由于单细胞测序数据的稀疏性，调控子活性比单基因表达更稳健。

   随后，我们比较了OSCAR在测定干扰效应方面与另外两种方法scMAGeCK和MIMOSCA的性能（参见“方法”）。我们使用相对于Hnf4a，每个干扰中前200个可变特征的相关系数作为评价指标。三种方法彼此高度一致，斯皮尔曼相关系数介于0.89到0.97之间（附加文件1：图S6a-c）。接下来，我们通过比较从不同数据子集计算的干扰效应与从整个数据集计算的结果的一致性来衡量方法的稳健性。OSCAR和scMAGeCK在稳健性方面可比，而MIMOSCA在不同轮次的下采样中变化较大（附加文件1：图S6d）。根据稳健性评分，我们估计获得稳健干扰效应所需的细胞数为OSCAR和scMAGeCK相对于原始MIMOSCA版本所需细胞数的30%到40%。

   我们发现，与OSCAR中识别出的顶级可变调控子中的主转录因子相关的GO术语，比在scMAGeCK或MIMOSCA中识别出的顶级可变转录因子更与肝功能相关（附加文件1：图S6e）。同样，OSCAR在ESC CROP-seq数据中显示出更多与细胞分化相关的调控变化（附加文件1：图S6f）。这些结果表明，与基于基因表达的分析相比，基于调控子分析可以更好地揭示来自整个调控网络变化的生物学见解。

   为了识别肝细胞形成的调控因子，我们通过在去除靶向单细胞少于40个的sgRNA后，计算所有受扰动细胞中调控子活性的平均值，对基因扰动进行了聚类（图2a）。使用k均值聚类，我们将受扰动基因划分为4个扰动模块（P1-P4），将调控子划分为5个程序（R1-R5）（图2c）。我们还从数据中推断了扰动模块与调控子程序之间的调控网络（图2d）。有趣的是，P2组和P4组中的基因显示出比其他组更显著的调控作用（图2d）。P4中的扰动抑制了调控子程序R3，其特征包含肝细胞分化、葡萄糖和脂质代谢等术语。相比之下，P2 的扰动激活了 R3，但抑制了与胆管上皮细胞分化和有丝分裂细胞周期密切相关的 R1 和 R2 的活性（图 2d）。我们观察到著名的分化增强子 Hnf4α 和抑制子 Hdac3 分别位于 P4 和 P2，这表明 P4 可能代表肝细胞形成的正向调控组，而 P2 代表负向调控组（图 2d）。

   接下来，我们评估了每个被扰动基因与每个调控程序中前20个可变调控子活动之间的关联（附加文件1：图S7）。我们发现，P2组的扰动增加了以Foxa3和Cebpa为中心的调控子活动，这些已知是参与肝细胞特化和分化的关键转录因子，以及以Ppara和Nr1h4为中心的调控子，这些调控子参与代谢调控（图2e和附加文件1：图S7）。相反，P4组基因的扰动对这些调控子产生了相反的效果（图2e和附加文件1：图S7）。在这些前20个可变调控子中，我们还发现了决定肝细胞命运的关键信号通路转录因子：Tead4被认为是Hippo-YAP信号下游的YAP转录复合物的DNA锚蛋白，它控制胆管细胞特化和肝细胞转分化。Tcf7l2/Tcf4作为Wnt信号下游与β-连环蛋白的转录伙伴，也必需于肝脏发育及肝细胞的出生后增殖。

综上所述，这些结果表明，我们用于scCRISPR数据分析的计算框架在识别关键细胞命运调控因子并从整个调控网络的变化中推断其生物功能方面是可靠的。

Modulators identified from OSCAR could be ranked based on the perturbation effects  on hepatocyte marker expression

可以根据对肝细胞标记物表达的扰动效应，对从OSCAR中鉴定出的调节因子进行排序

   为了进一步探索模块 P2 和 P4 中候选调控因子的功能，我们尝试在单基因表达水平上绘制其对肝细胞分化的干扰效应。由于 CRISPR-Cas9 系统编辑结果存在变异性，单个细胞中存在的 sgRNA 并不总是意味着目标基因已被敲除。为了准确绘制干扰效应，我们应用了 MIMOSCA 框架来推断每个细胞的干扰概率 （图 3a）。对于非靶向对照，干扰概率的分布呈正态分布，均值为 0.5。相比之下，针对候选调控因子的 sgRNA 显示出干扰概率的双峰分布，提示未干扰细胞与已干扰细胞的分离（图 3b）。为了识别这些未干扰的细胞，我们在 P2 和 P4 组中每个基因的干扰概率分布上拟合了一个双组分高斯混合模型（图 3a 及补充文件 1：图 S8）。在去除未干扰细胞后，我们发现在 P2 干扰组中 9 个肝细胞特异性标记基因（包括 Alb、Ttr、Tff3 和 Cyp3a13）的表达模式升高（图 3c），而在 P4 干扰组中则呈相反的表达模式（图 3d）。这些结果支持了这些候选基因的干扰直接影响成熟肝细胞功能的出现，例如白蛋白的分泌和细胞色素 P450 酶的表达。因此，我们将 9 个肝细胞标记基因的表达整合为肝细胞调控评分，通过该评分可以对 P2 和 P4 中的候选调控因子进行排名（图 3e、f）。

Deletion of Fos boosts hepatocyte differentiation by upregulating metabolic pathways

删除Fos通过上调代谢途径促进肝细胞分化

   在排名靠前的候选基因中，Fos 干扰显示出最高的肝细胞调控因子评分（图 3e）。为了进一步研究 Fos 在肝细胞分化和成熟中的作用，我们生成了稳定的 Fos KO mICO 系列，并在 EM 或 DM 条件下将其与非靶向（NT）对照 mICOs 进行了比较（图 4a, b）。在形态上，Fos KO 类器官与 NT mICOs 非常相似（补充图 1: 图 S9a）。通过细胞活力测定，我们发现其生长速率相当（补充图 1: 图 S9b）。在用扩增培养基培养的Fos KO类器官中，胆管细胞标志物（Sox9和Spp1）上调，而肝细胞标志物通过qRT-PCR几乎无法检测到（附加文件1：图S9c）。在用分化培养基诱导后，整体上，NT和Fos KO类器官中的胆管细胞标志物显著减少，而所有肝细胞标志物（Alb、Ttr、Apoa1、Mup20和Mrp2）显著增加（附加文件1：图S9c）。有趣的是，五种肝细胞标志物中有四种在Fos敲除类器官中的表达水平显著更高。这些结果表明，Fos 是肝细胞命运的条件性调控因子，而 Fos 的缺失在分化诱导时显著增强了肝细胞的分化。

   为了进一步了解Fos敲除所观察到的效应背后的分子机制，我们对经历分化诱导的Fos敲除（Fos KO）和NT mICO进行了RNA-seq分析。RNA-seq数据的差异基因表达分析显示，Fos KO mICO中有840个基因上调，397个基因下调（图4c及附加文件2：表S6a）。如预期，多种常见的肝细胞标志物，如Alb、Apoa1、Apob、Apoc2、Cyp2c29、Cyp2c66和Cyp3a11，位于上调基因之中（图4c）。有趣的是，功能分析显示，上调基因在多种肝脏功能相关的过程中过度富集，包括脂质代谢、外源物代谢和谷胱甘肽代谢（图4d及附加文件2：表S6b）。具体来说，主要代谢酶如细胞色素P450（Cyp450）和UDP葡萄糖醛酸转移酶（UGT），这些酶在解毒中占重要作用，也显著富集（图4e及附加文件2：表S6b）。此外，我们观察到参与脂肪酸代谢（Cd36、Pparg）、胆汁酸稳态（Cyp27a1、Akr1d1、Malrd1、Nr5a2）以及胆汁分泌的Abc转运蛋白（Abcc2、Abcg5和Abcg8）的代表性基因显著上调（图4f及附加文件2：表S6b）。与Alb mRNA水平升高一致，免疫荧光染色显示Fos KO mICO中的蛋白水平高于NT mICO（图4g、h）。Fos KO mICO还显示Alb分泌和胆汁酸生成显著增加（图4i、j），表明它们在肝细胞功能方面更加成熟。

   由于Fos敲除导致我们的小鼠ICO模型中肝细胞分化加速，我们想探究Fos是否在体内肝细胞分化中发挥作用。通过分析肝脏发育过程中Fos的表达模式，我们发现Fos在E11.0时高表达，但随后显著下降（图4k），这与Hnf4α及在肝细胞发育过程中上调的其他20种转录因子的趋势相反[43]，提示Fos的抑制对于肝细胞分化的启动是必需的[8]。另一方面，已有研究证明Fos缺失可在肝脏条件性敲除小鼠模型中上调代谢通路[44]，这与我们从类器官模型获得的数据一致。总的来说，我们提出Fos是肝细胞分化和成熟的抑制因子。

FOS perturbation in human ICOs potentiates hepatocyte differentiation

在人类ICO中，FOS扰动增强了肝细胞分化

   为了探究Fos缺失对肝细胞分化和成熟的增强效应是否在小鼠和人类中保持一致，我们在人体肝内胆管类器官（hICO）模型中评估了人FOS缺失的影响。为此，我们首先通过从接受肝切除术的供体中分离胆管上皮细胞生成hICO。hICO在表达谱和在特定培养基中转化为类肝细胞的能力上与小鼠ICOs（mICOs）相似。随后，人类ICOs被转导了一种同时表达Cas9和针对FOS的sgRNA的一体化慢病毒，以生成FOS缺失的类器官，并使用与mICOs分化类似的策略进行分化（图4a）。

   值得注意的是，与非靶向对照组相比，通过qRT-PCR评估显示，FOS缺失的ICO在常见肝脏基因中表现出显著升高的表达，包括ALB、TTR、CYP3A4、CYP2B6、APOC3、APOC1、SULT1A1和UGT1A1（图4l）。与ALB mRNA水平的增加一致，免疫荧光染色显示FOS缺失的hICOs中ALB蛋白水平的增强（图4m）。这些结果表明，在人类 ICO 中删除 FOS 也促进了肝细胞分化。

Ubr5 ablation in liver delayed hepatocyte differentiation and maturation

肝脏中Ubr5的缺失延缓了肝细胞的分化和成熟

   在P4调控因子中，Chaf1α和Ubr5的扰动具有最低的肝细胞调控评分（图3f）。然而，作为染色质组装因子1（CAF1）复合物的核心组分，其伴侣Chaf1b在使用Mx1-Cre（在造血和肝系中活跃）进行条件性缺失时会导致出生后死亡 。为了便于样本收集和分析，我们选择研究Ubr5的功能，而Ubr5在肝脏中尚未被研究。为此，我们首先按照图4a所示的方式生成了Ubr5缺失的单个mICO，并在DM条件下对其进行分化。转录组分析显示，Ubr5敲除的mICO中下调的基因显著与肝细胞相关过程相关，包括葡萄糖稳态、脂肪酸代谢过程、激素代谢过程、外源物质代谢过程和凝血（附加文件1：图S10和附加文件2：表S7），提示Ubr5在肝细胞分化和成熟中具有增强作用。

   为了进一步解析Ubr5在体内的作用，我们生成了Ubr5条件性敲除小鼠（Ubr5^fl/fl）。与Albumin-Cre小鼠交配后，带有LoxP位点的第6外显子和第7外显子将在肝细胞（肝实质细胞和胆管细胞）中特异性删除，从而导致肝脏中Ubr5的功能缺失（图5a）。利用肝灌注分离的肝细胞（图5b），我们通过Western印迹分析确认了Ubr5被高效敲除（图5c）。Ubr5敲除肝脏的大小与Ubr5野生型相当，在21天内未观察到肝脏形态或结构的显著变化（附加文件1：图S11a）。为了直接评估对肝细胞分化的影响，我们在小鼠3周时处死，并对若干经典肝细胞及肝芽细胞标志物进行免疫组织化学（IHC）分析，包括Mup、Ttr、Hnf4α和Afp。结果显示，Ubr5缺失后Mup和Ttr的染色显著降低（图5d及附加文件1：图S11b）。此外，Ubr5敲除小鼠血清中的白蛋白水平降低（图5e），提示肝脏中白蛋白的合成受损。

   为了在全球范围内描绘肝细胞中的基因表达谱，我们对来自3周龄Ubr5野生型（WT）和敲除（KO）小鼠的分离肝细胞进行了RNA测序分析。对Ubr5敲除肝脏中266个差异表达基因进行的GO术语富集分析显示，与脂质代谢相关的代谢通路显著富集，例如烯类化合物代谢过程、类固醇代谢过程和长链脂肪酸代谢过程（图5f, g及附加文件2：表S8a, b）。确实，如Oil Red O染色所示，与野生型肝脏相比，Ubr5敲除肝脏在3周时脂质积累增加（附加文件1：图S11c, d），提示Ubr5在调控脂质代谢通路中具有特定作用。

   在Ubr5敲除肝脏中下调的39个基因中，有7个基因在Ubr5敲除mICO中也显著下调，相较于它们的对应对照，包括几个经典的肝细胞标志物（Sult5a1和Mup成员）（图5f和附加文件2：表S8c）。GSEA分析进一步确认，一组成熟肝细胞富集基因在Ubr5敲除肝细胞中下调（图5h及附加文件2：表S8d），而一组胚胎肝脏富集基因在Ubr5敲除肝细胞中上调（图5i及附加文件2：表S8d）。这些结果表明，肝脏特异性Ubr5缺失导致肝细胞分化和成熟延迟。最后，为了调查Ubr5在肝细胞分化和成熟中发挥作用的时间窗口，我们从出生后不同天数的小鼠中分离肝组织，并进行qRT-PCR检测经典的肝细胞和肝母细胞标志物。总体而言，Ubr5的缺失在P7-P28期间延缓了分化，这由肝细胞标志物的减少表明，如Alb、Ttr、Cyp2c69和Hnf4α（图5j）。有趣的是，肝母细胞标志物Afp在P21时增加（图5j）。这些结果表明，Ubr5在小鼠肝细胞的出生后发育中发挥作用。

单细胞CRISPR筛选能够实现多基因的高通量扰动，同时结合转录组学后果的功能读出[16-18]。在这里，我们首次在三维类器官系统中应用了scCRISPR筛选，以探究肝细胞命运的新调控因子。我们开发了OSCAR，用于基于其对从scCRISPR数据构建的调控网络的扰动效应来识别转录调控因子。经过类器官和小鼠的功能验证，Fos和Ubr5被证明是肝细胞命运的调控因子。

我们的OSCAR展示了类器官中scCRISPR筛选如何用于揭示体内发育背后的转录调控机制。该数据分析框架提供了一种方法学，可以轻松转移到其他系统中，用于识别复杂生物过程的决定因素。随着基于类器官的应用取得成功，我们计划在体内应用OSCAR，以进一步解析肝脏发育、再生和肿瘤发生的基因回路。虽然将sgRNA传递到胎肝具有挑战性，但这一问题可能通过最近报道的转基因可诱导马赛克sgRNA系统[46]

得以解决。技术上，我们研究的一个主要进展是将scCRISPR筛选应用于类器官系统。与二维细胞培养不同，三维类器官复现了体内组织的结构和行为。与iPSC系统相比，胆管细胞类器官分化系统提供了更便捷的一步分化方案，并在传代过程中具有更高的基因组稳定性[13]，为筛选提供了一个更易于操作的系统。然而，以往在类器官中的CRISPR筛选依赖于细胞增殖作为读出[47-51]，这会限制在复杂过程（如分化、成熟和衰老）中描绘调控因子的能力。scCRISPR筛选通过使用每个单细胞的全转录组作为读出，将基因与复杂表型连接，这对于异质性的类器官系统尤其有用。为了研究大脑发育中的神经命运调控因子，Fleck等人在iPSC中扰动了20个转录因子，并从中生成了基因马赛克神经类器官。背侧前脑承诺的调控因子是基于scRNA-seq数据中不同细胞簇中sgRNA的富集情况而鉴定的[52]。

在我们针对肝细胞命运调控因子的类器官内单细胞CRISPR (scCRISPR) 筛选中，我们开发了一种策略，基于调控网络的变化从scCRISPR筛选数据中识别关键调控因子。与以往方法相比，OSCAR框架具有一些优势。首先，通过使用从筛选数据中得出的以转录因子(TF)为中心的基因模块的活性，我们能够减轻scCRISPR筛选中固有噪声的影响，从而减少可靠测量干扰效应所需的细胞数量。其次，我们能够解析复杂过程中的不同功能通路，并将其与被干扰的基因联系起来。我们获得了与肝细胞功能直接相关的模块，例如调控肝细胞在脂质和葡萄糖代谢中酶表达的那些模块。尽管这项研究是在体外的类器官中进行的，但这些基因模块重现了小鼠肝脏体内发育的一部分调控网络。因此，我们的OSCAR提供了一种快速、可靠的单细胞CRISPR筛选分析方法，可用于研究其他复杂生物过程中的调控程序。

在基于整体调控特征鉴定关键调控因子后，我们根据基因表达模式将遭受干扰的细胞与未遭干扰的细胞分离，并去除每个 sgRNA 对应的未遭干扰细胞，以确保能在类器官中的异质细胞群体中准确映射干扰效应。我们能够根据调控因子对肝细胞标志基因表达的直接影响对其进行排序。我们验证了排名靠前的正负调控因子的功能。Fos 基因敲除直接促进类器官中肝细胞的分化。Fos 不仅作为一个已知的癌基因，还被报道在多条细胞谱系中充当命运调控因子。持续缺失 Fos 会阻止破骨细胞的分化，并导致向巨噬细胞的谱系转变 [53]。在体外过表达 Fos 抑制了软骨细胞的分化 [54]。我们发现 Fos 在肝细胞分化和成熟中具有特定作用，因为缺失 Fos 会显著激活来自人类和小鼠 ICO 的类肝细胞的肝脏代谢通路和功能。与我们的观察一致，小鼠肝脏中 Fos 的条件性敲除也导致代谢通路上调，反之亦然 [44]。FOS 蛋白在小鼠和人类中的功能一致性也显示了在基因背景统一的模型中进行基因筛选的潜力。有趣的是，FOS 也被报道为 Hippo-Yap 信号的直接靶点，用小分子 T5524 抑制 FOS 活性可以挽救由 Yap 引起的肝脏器官过度生长 [55]。结合我们的数据，FOS 可能是一个潜在的可药物干预基因，用于重塑癌症中去分化肝细胞的代谢状态。

我们功能性验证的另一个调控因子是Ubr5，小鼠中Ubr5的构成型敲除会导致胚胎致死[56]，而在早期B淋巴细胞中条件性破坏Ubr5的催化结构域会损害B细胞的成熟，表明Ubr5在细胞命运调控中的作用[57]。我们发现Ubr5缺失会延迟肝细胞的分化和成熟，这揭示了该调控因子在肝脏发育中的重要性。转录组分析显示脂质代谢存在明显缺陷，且在3周大的Ubr5敲除小鼠肝脏中观察到的脂质积累增加进一步支持了这一点。Ubr5调控肝细胞分化的潜在分子机制仍需进一步研究。鉴于Ubr5是E3连接酶，寻找Ubr5的底物及其与其他蛋白的相互作用可能提供更多见解。我们的筛选实验是使用ICO进行的，ICO具有胆管细胞特性，并在诱导下可以转化为类肝细胞。我们在筛选中鉴定的调控因子参与胆管细胞-肝细胞身份转换。虽然我们已经验证了Ubr5在小鼠肝脏发育中的作用，但采用iPSC向肝细胞分化体系的额外研究对于确定这些因子在人类肝细胞分化和成熟中的作用至关重要。

   总之，我们开发了OSCAR，一个使用调控子活动作为读出以解析类器官中基因敲除效应的框架。通过整合单细胞CRISPR和肝类器官系统，我们在类器官中实现了汇聚文库筛选，并鉴定了显著影响肝细胞命运的新型调控因子。我们的结果表明，

OSCAR是一种强大且可扩展的方法，用于发现细胞命运决定的新调控因子。

In-organoid single-cell CRISPR screening reveals determinants of hepatocyte differentiation and maturation - PMC

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10617096/

https://www.kmmu.edu.cn/Pages_2575_53828.aspx

https://www.pumch.cn/temporary/detail/34924.html

     将肝细胞用于基础研究和再生医学需要对决定肝细胞分化和成熟的遗传因素有全面的理解。在类器官中进行单细胞CRISPR筛选，可以将基因扰动与单细胞的平行转录组读数关联起来，为阐明细胞命运调控因子的作用提供了一种强有力的方法。然而，在数据分析中识别关键调控因子面临的一个重大挑战是转录因子（TFs）表达水平低，这使得由于单细胞测序中的噪声和丢失而难以准确估计。此外，通常与细胞命运转变相关的，不是转录因子的表达水平，而是转录级联中转录因子的活性变化。

类器官内单细胞CRISPR筛选揭示肝细胞分化和成熟的决定因素

该研究开发出一套基于类器官模型的单细胞CRISPR筛选及基于调节子分析的研究框架—OSCAR (Organoid-based Single-cell CRISPR screening Analyzed with Regulons)，并利用该框架解析和验证了新的肝细胞分化成熟调控因子。

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《在类器官中进行单细胞CRISPR筛选揭示肝细胞分化与成熟的决定因素》报道了OSCAR框架，该框架利用调控元活性分析单细胞CRISPR筛选数据，识别肝细胞命运关键调控因子。研究发现Fos缺失可促进小鼠和人类肝类器官分化，上调代谢基因；而Ubr5缺失则延缓肝细胞成熟。该研究为肝细胞再生医学提供了新靶点，并展示了类器官模型在细胞命运研究中的高效应用。

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类器官内单细胞CRISPR筛选揭示肝细胞分化和成熟的决定因素

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