Stereo-seq & 分子动力学--内吞逃逸导致癌症对抗体药物偶联物疗法产生耐药性

作者，Evil Genius

Ai与多组学的结合，现在发展的速度越来越快了。

今天我们分享文献，Stereo-seq & 分子动力学。

知识积累

Enfortumab vedotin（NECTIN4-ADC）是一种靶向NECTIN4的抗体药物偶联物，在尿路上皮癌中已显示出显著疗效，但原发性耐药和获得性耐药仍是实现持久疗效的主要障碍。

治疗耐药的一个关键原因在于肿瘤细胞固有的可塑性，这使其能够在治疗压力下进行动态适应。这种细胞可塑性使肿瘤细胞能够通过多种机制逃避ADC介导的细胞毒性。其中一种机制是抗原表达下调或完全缺失，这会损害ADC的结合。此外，ADC加工通路的改变也可能导致耐药。ADC与抗原结合后，会被内化并转运至溶酶体，在那里释放其细胞毒性有效载荷——单甲基奥瑞他汀E（MMAE）。然而，溶酶体转运或酶切过程的缺陷会减少有效载荷的递送。此外，多药耐药转运蛋白的上调可能促进细胞毒性有效载荷的外排，从而降低其在细胞内的积累和效力。

结果1、单细胞RNA测序揭示了PDCX基人源化小鼠在NECTIN4-ADC治疗前后的时间点

模型构建：研究者将人膀胱癌肿瘤细胞移植到人源化小鼠（huCD34+HSC-NCG）体内，建立肿瘤模型。

样本采集：在ADC治疗前，切取一侧肿瘤进行scRNA-seq（Pre-ADC样本）。对小鼠进行3个周期的NECTIN4-ADC治疗及1次再挑战后，对另一侧持续生长至约600立方毫米的残留肿瘤再次进行scRNA-seq（Post-ADC样本）。

TIME分析：对人源免疫细胞的分析显示，T细胞可细分为11个亚型（包括NK、CD4+、CD8+），单核髓系细胞分为10个亚型（包括巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞），这与人类原位膀胱癌样本高度一致。

结果2、过表达NECTIN4的肿瘤亚群通过抑制其内化来驱动NECTIN4-ADC耐药性。

耐药亚群的发现：通过单细胞测序，在ADC治疗后的肿瘤中鉴定出一个独特的耐药亚群（C1_NECTIN4+）。该亚群高表达ADC靶点NECTIN4，这与传统认为的“靶点下调导致耐药”的认知相反。

耐药机制：

内化受阻：在耐药细胞中，ADC药物主要停留在细胞膜上，无法被有效内化并转运至溶酶体。与之相关的细胞内吞通路显著下调。

有效载荷积累少：由于内化受阻，进入细胞内的有效载荷（MMAE）浓度远低于敏感细胞。

先前研究表明，肿瘤细胞对ADC疗法的耐药性主要归因于以下机制：（1）靶标表达下调，（2）抗体内化受损，（3）溶酶体功能障碍，以及（4）肿瘤细胞中药物外排增强。

排除传统机制：经典的多药耐药泵（如ABCB1/ABCG2）和溶酶体功能缺陷并非该耐药模式的主要原因。

表型稳定：即使在没有药物压力下，这种高表达NECTIN4且内化缺陷的表型仍能稳定维持至少7天。

体内验证：在小鼠模型中，该高表达NECTIN4的耐药细胞亚群同样表现出对ADC治疗的抵抗，且肿瘤内MMAE浓度显著降低。

结果3、AKR1C1抑制NECTIN4-ADC的内化

AKR1C1通过与NECTIN4的特定胞内结构域结合，物理上阻碍ADC药物的内化过程。

关键分子筛选：通过整合单细胞和 bulk RNA-seq 数据，筛选出121个重叠基因。进一步的功能筛选证实，AKR1C1 是导致耐药细胞（R-NECTIN4^High）对ADC不敏感的关键分子。敲除AKR1C1可恢复耐药细胞的药物敏感性。

作用机制是非酶活的：

在无脂（无底物）培养条件下，过表达AKR1C1仍能诱导耐药，表明其作用不依赖传统的酶催化活性。

免疫共沉淀实验证实，AKR1C1与ADC靶点NECTIN4蛋白存在直接的物理结合。

结合位点定位：

AKR1C1主要结合在NECTIN4的胞内结构域。

通过分子对接和动态模拟，确定了NECTIN4上第443-472位氨基酸残基是关键结合区域。删除该区域会显著减弱二者的结合。

竞争性结合位点：

AKR1C1的催化活性口袋恰好介导了其与NECTIN4的结合。

这意味着：靶向AKR1C1催化口袋的抑制剂（特别是5-PBSA和CPSA）不仅能抑制其酶活性，还能物理破坏AKR1C1与NECTIN4的相互作用，从而恢复ADC的内化和药效。

结果4、AKR1C1抑制AP2M1依赖的囊泡介导的NECTIN4-ADC内吞作用

核心机制：AKR1C1通过结合NECTIN4，物理遮挡其内化信号motif，从而阻止关键接头蛋白AP2M1的识别与结合，最终抑制了网格蛋白介导的内吞作用。

锁定关键内吞途径：通过筛选多种内吞途径，发现AKR1C1主要抑制的是网格蛋白介导的内吞作用。敲除该通路的关键基因CLTC，会显著削弱由AKR1C1敲除所恢复的药物敏感性。

发现内吞接头蛋白AP2M1：质谱分析发现，在耐药细胞中，内吞接头蛋白AP2M1与NECTIN4的结合显著减少。AP2M1的功能是识别货物蛋白（此处为NECTIN4）上的特定YXXΦ氨基酸序列基序，从而启动内吞。

物理遮挡机制：通过分子对接模拟发现，当AKR1C1与NECTIN4结合后，NECTIN4胞内段上的YXXΦ基序被物理遮挡；而在没有AKR1C1时，该基序是暴露的。这直接解释了AP2M1无法结合的原因。

验证相互排斥的结合模式：免疫共沉淀实验证实，NECTIN4、AKR1C1和AP2M1三者之间存在相互排斥的结合关系。敲除AKR1C1或使用抑制剂，会显著增强NECTIN4与AP2M1的结合；而过表达AKR1C1则会抑制二者的结合。

功能拯救实验：引入一个无法识别YXXΦ基序的AP2M1突变体，即使在敲除AKR1C1的情况下，也无法恢复ADC的敏感性和细胞内药物积累，进一步证明了该基序和AP2M1识别的关键作用。

AKR1C1就像一个“分子盖子”，盖住了NECTIN4上的“内吞钥匙孔”（YXXΦ motif），使得“开锁蛋白”AP2M1无法工作，从而导致ADC药物无法被细胞吞入。

结果5、AKR1C1招募WWP2以促进NECTIN4-ADC阳性EV的形成

AKR1C1通过其PPNY motif招募E3泛素连接酶WWP2，促进携带NECTIN4-ADC的细胞外囊泡（EVs）的形成与分泌，从而将药物排出细胞外。

耐药细胞改变药物清除方式：在耐药细胞中，被阻滞在膜上的NECTIN4-ADC复合物并未被传统溶酶体降解，而是主要通过细胞外囊泡途径被大量分泌排出。免疫电镜证实了囊泡内NECTIN4与ADC的共定位。

AKR1C1的核心驱动作用：敲除AKR1C1会显著减少囊泡中NECTIN4及ADC的含量；而过表达AKR1C1则会促进其进入囊泡。这表明AKR1C1直接参与了该过程。

关键功能motif PPNY：研究发现AKR1C1蛋白C端含有一个PPNY基序。该基序位于与NECTIN4结合面的另一侧，保持暴露状态。删除该motif会完全消除AKR1C1促进囊泡生成的功能。

招募WWP2蛋白：PPNY基序通常用于招募含有WW结构域的E3泛素连接酶。质谱和免疫共沉淀证实，AKR1C1特异性地招募了WWP2，且二者结合依赖于PPNY基序。在耐药细胞中，WWP2与NECTIN4的相互作用显著增强。

功能验证：敲除WWP2会显著减少耐药细胞囊泡中NECTIN4和ADC的含量。更重要的是，在同时敲除WWP2和AKR1C1的细胞中，即使再过表达AKR1C1，也无法恢复药物通过囊泡外排的能力。

AKR1C1不仅像“分子盖子”一样阻止ADC进入细胞，其另一端（PPNY基序）还像一个“招募抓手”，主动召集WWP2蛋白来将膜上的ADC复合物“打包”成囊泡送出细胞外，形成双重耐药保障。

结果6、驱动耐药细胞（R-NECTIN4High）形成的上游关键转录因子：ELF3

筛选关键转录因子：通过单细胞调控网络分析（SCENIC）结合差异基因筛选，从多个候选转录因子中确定，只有敲降ELF3能够消除R-NECTIN4High细胞的耐药性。

ELF3调控下游关键分子：

在R-NECTIN4High细胞中，ELF3的表达水平显著升高。

敲除ELF3会导致NECTIN4和AKR1C1的表达均显著下调。

敲除ELF3还能减少细胞外囊泡（EVs）中NECTIN4、AKR1C1和WWP2的含量，同时增强对ADC治疗的敏感性。

直接转录调控的证据：

生物信息学预测发现，NECTIN4和AKR1C1的启动子区域均存在ELF3的高置信度结合位点。

染色质免疫共沉淀（ChIP） 实验证实，在R-NECTIN4High细胞中，ELF3确实富集在这两个基因的启动子区域。

荧光素酶报告基因实验显示，敲降ELF3会显著抑制NECTIN4和AKR1C1的转录活性。

转录因子ELF3作为上游主开关，直接结合并激活NECTIN4和AKR1C1的转录，从而驱动了“高表达NECTIN4但内化缺陷”的耐药细胞亚群的形成。 这解释了该类耐药细胞的来源。

结果7、空间转录组学揭示了NECTIN4肿瘤亚群在耐药临床样本中的出现

临床样本验证：对6例转移性尿路上皮癌患者在接受NECTIN4-ADC联合抗PD-1治疗前后的配对肿瘤样本进行分析，发现ADC治疗后出现进展的耐药病灶中，NECTIN4表达水平普遍升高，而非传统的抗原丢失。

鉴定出耐药肿瘤状态：通过非负矩阵分解（NMF）分析，从治疗后样本中鉴定出一个转录特征独特的肿瘤状态（NMF3）。该状态是治疗后样本中最主要的肿瘤状态，其特征是NECTIN4、AKR1C1和ELF3协同高表达。

耐药状态富集：该NMF3评分在治疗后的肿瘤细胞中显著高于治疗前，表明这种“NECTIN4高表达”的肿瘤细胞状态是在治疗压力下被筛选富集的，主要与耐药病灶相关。

临床与临床前模型一致：

相关性分析证实，在患者来源的肿瘤细胞中，NECTIN4、AKR1C1和ELF3三者表达呈显著正相关。

通路富集分析显示，该临床耐药状态与临床前模型中发现的耐药程序具有主要的转录特征重叠。

结果8、靶向AKR1C1作为逆转耐药策略

选择靶向AKR1C1的优势：相比于靶向上游转录因子ELF3（缺乏特异性抑制剂且可能影响正常上皮分化），靶向AKR1C1具有独特的“双重增敏”效果：既能抑制细胞外囊泡介导的药物外排，又能恢复ADC药物的内化。

筛选安全有效的抑制剂：在两种候选抑制剂（5-PBSA和CPSA）中，5-PBSA显示出更好的体内耐受性（无显著肝毒性或肾毒性），因此被选用于后续实验。

联合治疗显著增效：

皮下移植瘤模型：5-PBSA与NECTIN4-ADC联用，显著抑制了耐药肿瘤的生长，并延长了小鼠生存期。

原位膀胱癌模型：同样观察到显著的疗效提升。

三联疗法（+免疫治疗）效果更佳：在人性化小鼠模型中，NECTIN4-ADC + 5-PBSA + 抗PD-1 三联疗法相比双药联用，进一步显著抑制了肿瘤生长。

免疫微环境改善：三联疗法显著增加了肿瘤内CD8+ T细胞的比例和功能，同时减少了免疫抑制性巨噬细胞（TAMs）的浸润。这表明靶向AKR1C1不仅能直接增敏ADC，还能重塑免疫微环境，与免疫治疗产生协同效应。

最后，来看看方法

Stereo-seq数据分析

分子对接/分子动力学

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