第13篇HD文章--结直肠癌中不同调节性T细胞亚群的对立功能

作者，Evil Genius

从发文章的趋势来，利用HD技术的文章“产出”的速度明显见快，看来和单细胞，visium等技术是一样的，一个新技术的产生到文章大规模产出，大约就是2年时间，窗口期就是这2年，过了也就过了。

而且现在的文章，多组学的趋势越来越强烈，基因组（内因） + 单细胞空间（外因）快成了标配。

今天我们分享HD文章

知识积累

调节性T细胞在实体器官癌症中的富集通常与不良预后相关；然而，结直肠癌是一个显著的例外。

在人类结直肠癌中，IL-10⁺和IL-10⁻ Treg的丰度分别与良好和不良预后相关。相应地，IL-10⁺和IL-10⁻ Treg细胞在邻近正常结肠组织和肿瘤中表现出相反的富集模式。

在肿瘤微环境中，Treg细胞调控其他免疫和非免疫辅助细胞，或直接作用于肿瘤以促进其进展。

实体器官癌症中肿瘤浸润Treg细胞的显著富集通常与不良预后相关。

较高的IL-10+ 和IL-10− Treg丰度分别与良好和不良的生存率相关。

结果1、AKP肿瘤是人类MSS结直肠癌的可靠实验模型

模型构建与特征相似性：

通过将携带Apc缺失、Trp53缺失及KrasG12D突变（简称AKP）的小肠干细胞类器官原位移植到小鼠盲肠壁，成功诱导出肿瘤。该肿瘤在形态学、驱动基因突变、转移途径（肠系膜淋巴结和肝脏） 等方面高度模拟了人类CRC的病理特征。

免疫微环境的高度模拟：

AKP肿瘤的微环境表现出显著的免疫抑制特征：总免疫细胞浸润减少，但调节性T细胞和巨噬细胞富集，且效应CD8+ T细胞活性较低。这与高突变的MC38肿瘤（MSI-H模型）形成鲜明对比，且这种免疫特征与相应类型的人类CRC（MSS型）患者高度一致。

治疗反应的一致性：

该模型成功复现了临床治疗困境：AKP肿瘤对PD-1阻断疗法具有耐药性（治疗后肿瘤体积无显著变化，仅Treg细胞轻微增加），而对照的MC38肿瘤则对该疗法敏感。这进一步验证了该模型在模拟人类MSS CRC治疗反应方面的可靠性。

结果2、AKP肿瘤相关的调节性T细胞与效应T细胞异质性（Marker注意搜集）

Treg细胞形成两个细胞cluster，根据Il10的表达注释为IL-10+ 和IL-10− Treg细胞。两者均有结肠和肿瘤细胞分布，但大多数IL-10+ Treg细胞位于盲肠。相比之下，IL-10− Treg细胞在肿瘤中富集，这暗示了IL-10+ 和IL-10− Treg细胞在MSS CRC中可能具有不同的功能

在正常结肠中，IL-10+ Treg细胞代表一种稳定的、终末分化的细胞状态；在AKP肿瘤、相邻正常盲肠组织以及引流淋巴结中，大多数经YFP标记的预先存在的IL-10+ Treg细胞仍保持IL-10+ 状态。

肿瘤植入后2周，大多数IL-10+ Treg细胞是新生成的，因为它们缺乏YFP表达，这表明IL-10+ Treg细胞快速更新，并由其活化的IL-10− 对应细胞补充。

结果3、肿瘤浸润IL-10+ 与IL-10− Treg细胞亚群的差异基因表达程序

CRC中IL-10+ 和IL-10− Treg细胞亚群的动态变化暗示了它们不同的基因调控和转录特征。在此背景下，前者主要表达编码转录因子RORγt的Rorc基因，而后者则表达编码Helios的Ikzf2转录本。

为了识别IL-10+ 与IL-10− Treg细胞表达的转录模块，采用了Hotspot算法，并识别出每个已注释Treg细胞亚群特有的基因模块。

使用chromVar对ATAC-seq数据的分析表明，虽然IL-10+ 和IL-10− Treg细胞在其独特的可及染色质位点上共享某些转录因子结合基序的富集，但NR4A家族基序选择性地在肿瘤浸润IL-10− Treg细胞中富集。这一结果表明，肿瘤驻留的IL-10− Treg细胞经历了更强的T细胞受体信号传导，这与RNA-seq分析暗示的它们更高的活化状态一致。支持这一观点的是，对肿瘤浸润IL-10+ Treg、IL-10− Treg和PD-1+ Th1细胞的基因评分分析显示，在所有三个亚群中，肿瘤浸润IL-10− Treg细胞的TCR信号相关基因表达最高。总之，这些结果表明肿瘤浸润IL-10+ 和IL-10− Treg细胞之间存在功能差异。

结果4、IL-10+ 与IL-10− Treg细胞在MSS CRC中发挥相反功能

功能对立性的实验验证：

利用两种互补的基因工程小鼠模型，实现了对IL-10+ Treg和IL-10− Treg的选择性清除。

清除IL-10− Treg细胞导致肿瘤显著缩小，伴随单核细胞浸润增加和CD8+ T细胞反应增强，表明该亚群具有促肿瘤功能。

清除IL-10+ Treg细胞反而使肿瘤增大50%，表明该亚群在肿瘤微环境中发挥着保护性的抗肿瘤功能。

对免疫微环境的差异化调节：

IL-10+ Treg主要抑制Th17反应（抑制IL-17、IL-22产生）。清除后导致3型免疫反应增强（髓系细胞增加），特别是促进了促肿瘤的Spp1+ TAMs的扩增。

IL-10− Treg主要抑制Th2和CD8+ T细胞反应。清除后释放了IFNγ+ CD8+ T细胞和Th2细胞，重塑了免疫反应的“基调”。

机制与临床关联的暗示：

IL-10− Treg高表达Pdcd1（PD-1），这解释了为何在PD-1阻断治疗后这类细胞反而可能扩增，从而揭示了MSS CRC对PD-1疗法天然耐药的潜在机制（清除促肿瘤亚群失败）。

实验排除了Treg自身产生IL-17作为主要功能机制的可能性（两亚群均几乎不表达IL-17）。

结果5、IL-10+ Treg细胞通过限制IL-17产生来抑制结直肠癌肿瘤

IL-17信号除了促进血管生成和促肿瘤髓系细胞的募集外，还参与促进肠上皮细胞转化的早期阶段。

利用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术生成了IL-17RA缺陷的AKP类器官。植入盲肠2周后，IL-17RA缺陷的肿瘤显著小于对照组，这提示在体内，IL-17驱动的AKP肿瘤生长依赖于通过IL-17RA的直接信号传导。

在IL-10+ Treg细胞缺失的情况下，2型细胞因子的减少不太可能以非冗余的方式导致CRC肿瘤负荷的增加。

既往研究表明，Th17细胞可以被IL-10R信号直接调控，以响应由Foxp3+ 和Foxp3− CD4+ T细胞产生的IL-10。

清除IL-10+ Treg细胞通过IL-17R信号加速了肿瘤生长——一旦IL-10R介导的抑制被解除，IL-17产生增加，进而激活该信号通路。

虽然肿瘤浸润的IL-10− Treg细胞如预期般促进CRC进展，但IL-10+ Treg细胞以依赖于IL-10信号的方式抑制原发性CRC肿瘤，并且Treg来源的IL-10限制了IL-17的产生，而IL-17直接作用于CRC肿瘤细胞以促进其生长。

结果6、Treg群体的二分性在人类结直肠癌中是保守的

用重组人IL-17处理来自人类患者的肿瘤类器官，加速了肿瘤生长，这表明在小鼠中观察到的IL-10+ 与IL-10− Treg功能二分性可能在人类CRC中是保守的。

亚群存在与组织分布：

在人类MSS CRC中，通过单细胞多组学技术鉴定出两个Treg亚群，分别转录类似于小鼠的IL-10+ Treg（表达IL10/RORC）和IL-10− Treg（表达IKZF2）。

在空间分布上，IL-10+ Treg富集于邻近正常组织，而IL-10− Treg富集于肿瘤灶内，这与小鼠模型中的观察高度一致。

转录调控的保守性：

两个亚群在染色质可及性和转录因子基序富集上表现出保守特征（IL-10+ Treg富集RORC基序，IL-10− Treg富集GATA/NR4A基序）。

人类亚群特异性表达的基因（如IL-10− Treg高表达IKZF2/GATA3/CCR8，IL-10+ Treg高表达MAF/ZEB2）与其小鼠对应模块显著重叠，证实了跨物种的保守性。

临床预后的反向关联：

通过对102例患者的数据反卷积分析发现：

IL-10+ Treg高丰度的患者生存率显著更好（对应其抗肿瘤功能）。

IL-10− Treg高丰度的患者生存率显著更差（对应其促肿瘤功能）。

这直接验证了小鼠实验中观察到的功能二分性在人类临床结局中的体现。

跨癌种的普遍性：

在泛癌种T细胞图谱中，同样识别出与上述两个亚群转录相似的细胞cluster（C2/IL-10−样和C6/IL-10+样）。

这两个亚群不仅存在于CRC，还共同存在于基底细胞癌、头颈部鳞癌、胃腺癌等其他屏障组织肿瘤中，提示这种Treg功能二分性可能是屏障组织癌症的共性特征。

结果7、肝癌转移灶中调节性T细胞的组成与功能

与原发性结肠肿瘤不同，在自发形成的肝转移灶中，Treg细胞群体以IL-10− Treg（促肿瘤亚群）为主，而IL-10+ Treg（保护性亚群）的存在极少。

免疫微环境改变：

IL-10+ Treg的稀缺伴随着巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞在肝转移灶中的浸润增加，这模拟了在小鼠模型中清除IL-10+ Treg后观察到的免疫环境变化。

尽管IL-10+ Treg缺失，但由于肝脏中缺乏微生物抗原，Th17细胞的频率并未增加。

治疗反应的根本差异：

基于肝转移灶中“促肿瘤”亚群占据主导地位，全面清除所有Treg细胞成功减轻了肝脏的肿瘤负荷。

这与原发性结肠肿瘤中“全面清除Treg细胞无效”（因保护性与促肿瘤亚群功能抵消）的结果形成鲜明对比。

最后，来看看方法，看起来有点难

scRNA + scATAC部分（基础质控部分起码尝试了2个月）

visium HD部分

生活很好，有你更好。