Nat. Methods | 樊荣团队开发基于成像和测序的空间多组学方法DBiTplus，实现同一组织切片的单细胞空间转录组与蛋白质分析

单细胞技术正以迅猛的发展势头被生命科学研究广泛运用，但存在缺乏空间背景信息的局限性，空间组学的出现解决了这一问题。在空间组学技术中，原位测序或成像技术具有更高的空间分辨率和灵敏度，但可能缺乏全转录组覆盖；基于测序的方法能提供全转录组覆盖，但通常以牺牲高空间分辨率为代价。此外，多重蛋白质成像技术也已开发，可实现蛋白质标记物的单细胞分辨率分析，用于原位细胞分型。

目前，大多数空间多组学技术都是先分别在相邻或连续的组织切片上进行单个空间组学检测，然后对多模态数据进行计算整合。但即使是来自同一组织的相邻切片之间，细胞组成和组织结构也存在差异，因此通过计算整合多模态数据可能并非最佳选择，因为组织切片之间几乎不可能实现完全一致。因此，有必要开发新的方法，在同一组织切片上进行空间分辨率的多模态和多组学分析。

近日，耶鲁大学樊荣教授团队与合作者在Nature Methods发表文章“Integration of imaging-based and sequencing-based spatial omics mapping on the same tissue section via DBiTplus”，介绍了一种整合多模态空间组学的方法DBiTplus，通过将空间分辨转录组测序与多重免疫荧光（mxIF）成像相结合，实现了对同一组织切片中全转录组及蛋白质标志物的无偏倚共分析。利用包括冷冻小鼠胚胎、福尔马林固定石蜡包埋的人类淋巴结及淋巴瘤组织在内的多种样本，研究证实了DBiTplus从同一组织切片中生成高质量单细胞分辨率转录组与蛋白质数据的能力，既能实现细胞分型，又能对全转录组范围内的生物通路进行探究，突显了DBiTplus对具有挑战性临床样本的兼容性。

主要研究内容

标准DBiT-seq工作流程中，在组织裂解后，带有条形码的cDNA被回收、纯化并扩增，以进行双端测序，从而生成空间基因表达图谱。将DBiT-seq与mxIF结合的关键在于开发出既能从组织切片中释放cDNA又能保持组织完整性的技术。研究团队测试了多种cDNA提取方法，最终采用空间条形码标记后使用RNase H的酶解法，该方法在mxIF成像前能保持组织完整性和形态结构（图1a）。在成功获取cDNA并制备文库后，使用PhenoCycler-Fusion平台或CellScape平台对完整组织切片进行成像，并在同一组织切片上进行常规的H&E染色。

研究团队开发了计算流程将mxIF的细胞-蛋白质矩阵和DBiTplus的spot-基因矩阵整合，成为一个包含细胞类型标签和空间坐标的统一特征矩阵（图1b）。通过基于MaxFuse算法改进的方法将mxIF数据与多组学空间转录组进行整合对mxIF数据集进行注释；通过组织边界检测和图像转换技术，将mxIF图像和DBiT-seq图像进行处理，实现了不同成像模式下相同细胞的精确匹配与对齐；将mxIF分割结果映射到DBiTplus标记点，可估算特定细胞类型的基因表达情况，实现了超越现有反卷积工具的单细胞注释。随后研究团队将DBiTplus应用于新鲜冷冻样本及固定包埋样本的处理流程进行了方法开发和优化，证实了DBiTplus生成高质量空间转录组数据并重现组织生物学的能力。

图1.DBiTplus工作流程及多模态数据的生物信息分析概述。

在E11型的石蜡包埋小鼠胚胎样本中，DBiTplus结果与标准DBiT-seq（在同一切片上）显示出高度相关性，共有27,884个重叠基因（图2）。每个spot捕获约1,200个基因和3,300个独特的分子标识符（UMI）。经CODEX成像后，无监督聚类分析确定了10个转录组簇，与CODEX数据中的解剖结构和空间蛋白质模式高度吻合。进一步分析表明，将CODEX和DBiT-seq整合，能够将DBiTplus区域的信号分解为不同的细胞类型（图2g）。

图2.DBiTplus技术用于对经过福尔马林固定、石蜡包埋处理的小鼠胚胎进行性能分析及空间多组学研究。

研究还利用DBiTplus对人类良性淋巴结相邻切片进行了检测，验证了其空间转录组分析的准确性。无监督聚类分析显示5个转录组簇，包括B细胞、髓质平滑肌细胞以及髓质索内壁的巨噬细胞（图3）。CODEX图像的细胞水平数据能够与DBiTplus spot的空间转录组数据对齐；每个DBiTplus区域都被进一步细分为纯细胞类型子，细胞类型分布符合已知淋巴结生物学特征，T细胞和B细胞占主导地位；相较于DBiTplus（转录组），CODEX（蛋白质）对T细胞亚型识别的贡献更大，而B细胞亚型（如GCB和浆细胞B细胞）则呈现相反趋势。

图3.固定石蜡包埋人类淋巴结组织切片的空间多组学分析。

研究对DBiTplus中的RNA -蛋白质一致性进行了评估，将空间转录组学与CODEX成像进行了比较，结果突出了DBiTplus在同一组织切片上同时映射RNA和蛋白质方面的强大能力，增强了细胞类型注释和空间定位的可信度。

将DBiTplus应用于人类淋巴瘤组织时，揭示了其独特的空间组织结构，并能够实现对淋巴瘤发展和转变的高分辨率映射，证实了DBiTplus从同一组织切片中生成高质量单细胞分辨率转录组与蛋白质数据的能力，解决了相邻切片间数据整合与配准的障碍。此外，DBiTplus 还能够捕捉到包括小RNA（尤其是 miRNA）的总RNA，为疾病演变的分子生物学机制提供了见解。

图4.人类淋巴瘤组织切片的空间多组学特征分析。

结 语

传统空间多组学方法是在相邻组织切片上分别进行不同检测，由于组织的异质性，这限制了对组织的对齐和多模态数据整合的准确性。该研究新开发的DBiTplus能够在同一组织切片上整合基于测序和基于成像的空间检测技术，解析单细胞分辨率的空间转录组，为组织结构和细胞相互作用提供了前所未有的见解，为空间多组学研究开辟了新途径。

DBiTplus采用空间条形码技术与RNase H介导的cDNA提取方法，可以完整保留组织结构实现多重蛋白质成像。通过对高分辨率成像的DBiTplus数据进行注释，实现了转录组和蛋白质组数据的精确共定位，这使基于成像的DBiTplus的反卷积得以实现，创建真正单细胞分辨率的空间转录组图谱。研究显示，DBiTplus可以实现全转录组空间分析，不受预先设计的panel限制，与同一组织切片上的高分光蛋白成像相结合，并且对于广泛应用具有灵活性和成本效益。DBiTplus还允许对包括小非编码RNA在内的总RNA进行无偏的全转录本分析，对发现新RNA生物学机制具有重要意义。

论文信息：

Enninful, A., Zhang, Z., Klymyshyn, D. et al. Integration of imaging-based and sequencing-based spatial omics mapping on the same tissue section via DBiTplus. Nat Methods (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-025-02948-0

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