【免疫学实验】揭秘蛋白互作：免疫沉淀与免疫共沉淀

在抗体研发和蛋白质研究中，我们常常需要从复杂的细胞环境中“钓”出特定的目标蛋白。今天，我们就来聊聊两种核心的“打捞”技术：免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）。

🎣 一、 免疫沉淀（IP）：精准捕获目标蛋白

免疫沉淀是利用抗体从复杂的混合物中分离特定蛋白质的技术。

1. 抗体的制备为了获得针对膜蛋白等难以纯化蛋白的抗体，通常采用全细胞或粗细胞提取物对小鼠进行免疫接种。随后通过杂交瘤技术，生产出能识别这些细胞表面抗原的单克隆抗体。

2. 样本标记与结合为了检测抗体捕获的分子，我们需要对细胞进行标记：

• 代谢标记： 将细胞培养在含放射性氨基酸的培养液中，标记细胞内所有蛋白。
• 表面标记： 使用放射性碘或生物素特异性标记细胞膜蛋白（生物素可被亲和素便捷检测）。

标记后的细胞经非离子洗涤剂处理（破坏细胞膜但不干扰抗原-抗体结合），使蛋白释放并与抗体结合。

3. 分离原理抗体通常被固定在固体载体上（如亲和层析微球），或者利用金黄色葡萄球菌的蛋白A与IgG抗体的Fc区结合，从而将“抗原-抗体”复合物从混合液中沉淀分离出来。

📏 二、 蛋白质检测：电泳分析

分离出的蛋白质通常通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行检测。

• SDS-PAGE： 利用SDS赋予蛋白质负电荷，使其在电场中的迁移率主要由分子大小决定，从而根据条带位置判断蛋白分子量。
• 二维凝胶电泳： 这是一种更强大的技术，结合了等电聚焦（按等电点分离）和SDS-PAGE（按分子量分离）。
  • 第一向：在细管中进行等电聚焦。
  • 第二向：将胶条置于SDS-PAGE平板胶上垂直电泳。
  • 这种方法可以将复杂混合物中的数百个蛋白质点清晰地分开，用于分析蛋白质的等电点、丰度及翻译后修饰（如分子量变化）。

免疫沉淀与 SDS-PAGE 分析

免疫沉淀法用于从细胞裂解液中富集特定抗原。细胞可通过 ³⁵S-蛋氨酸代谢标记（标记所有新合成蛋白）或 表面碘化/生物素化（仅标记膜蛋白）进行示踪。裂解后，抗原与微球偶联的抗体结合，经洗涤去除非特异蛋白。随后，利用 SDS-PAGE 变性电泳将抗原从抗体上解离并按分子量分离。最后通过放射自显影（或显色）确定蛋白位置

🤝 三、 免疫共沉淀（Co-IP）：验证蛋白互作

如果说免疫沉淀是“抓单个”，那么免疫共沉淀就是“抓团伙”。

Co-IP 是 IP 技术的延伸，专门用于确定两种蛋白质之间是否存在物理性相互作用。

实验逻辑：

1. 捕获： 在含有潜在复合物的细胞提取物中，使用蛋白A的抗体进行免疫沉淀。
2. 验证： 将沉淀下来的复合物进行电泳和免疫印迹（Western Blot），使用蛋白B的抗体进行检测。
3. 结论： 如果在沉淀物中检测到了蛋白B，说明蛋白A与蛋白B在细胞内发生了物理结合。

总结

免疫沉淀技术不仅帮助我们纯化和鉴定蛋白质（分子量、等电点），更是通过免疫共沉淀技术，成为了揭示蛋白质之间物理相互作用的金标准实验方法。