致谢技能树文章：如何用单细胞数据做一个细胞亚群特异性的预后相关signature？

文章信息

本研究旨在解决膀胱癌免疫治疗缺乏有效生物标志物的问题，成功开发并验证了一个基于肿瘤特异性T细胞的五基因特征（TstcSig），用于预测患者对免疫治疗的反应和预后。基于单细胞测序数据，鉴定出与肿瘤特异性T细胞相关的关键基因。构建了一个包含 VAMP5, TIGIT, LCK, CD27, CACYBP 五个基因的预测模型（TstcSig）。TstcSig在多个独立的免疫治疗队列中均能有效预测患者的治疗结果。

题目：Identification of tumor-specific T cell signature predicting cancer immunotherapy response in bladder cancer by multi-omics analysis and experimental verification 期刊：Cancer Cell International 日期：20 July 2024 DOI：10.1186/s12935-024-03447-6

使用的数据

利用 GSE149652（单细胞+TCR数据） 找到目标基因。

基于 IMvigor210（膀胱癌免疫治疗队列） 构建 TstcSig 模型。

验证：

• 在 GSE176307（独立膀胱癌队列） 中进行内部验证。
• 在 PRJEB23709（黑色素瘤队列） 中进行外部和跨癌种验证。

通过 GSE145281（单细胞） 和 GSE171351（空间转录组） 从微观和空间层面阐释生物学机制。

通过 TCGA（泛癌数据） 探索该特征的普遍适用性。

主要结果

图一：肿瘤特异性T细胞相关基因的鉴定

利用 scRNA-seq 和 TCR-seq 探究肿瘤组织及其癌旁组织中T细胞的转录特征，从而鉴定了膀胱癌中的肿瘤特异性T细胞（图1A）。有39个枢纽基因在肿瘤特异性CD4 + T cells 和肿瘤特异性 CD8 + T cells 中均共同上调。GO功能富集分析表明，这39个枢纽基因主要与T细胞活化通路相关（图1E）。KEGG通路分析也揭示，这些基因在癌症中的PD-L1表达与PD-1检查点通路中显著富集（图1F）。

(A) UMAP图展示浸润性 CD4 + T cells（左图）和浸润性 CD8 + T cells（右图）中不同T细胞亚群的分布。蓝色：肿瘤特异性T细胞；黄色：非肿瘤特异性T细胞。

(B-C) 浸润性 CD4 + T cells（B）和浸润性 CD8 + T cells（C）中肿瘤特异性T细胞 vs 非肿瘤特异性T细胞的差异表达基因。图中标注了重点关注基因。

(D) 韦恩图展示浸润性 CD4 + T cells 与浸润性 CD8 + T cells 中肿瘤特异性T细胞的上调基因。

(E-F) 39个上调基因的 GO（E）和 KEGG 通路（F）富集分析结果。

图二：预后相关枢纽基因的鉴定

为进一步鉴定预后相关基因，在IMvigor210队列中进行了单因素Cox回归分析，发现8个肿瘤特异性T细胞相关基因与膀胱癌患者的总生存期（OS）显著相关（图2A）。此外，KM生存分析显示，在接受免疫治疗的膀胱癌患者中，VAMP5、TIGIT、LCK、CHORDC1、CD27和CACYBP的高表达与更好的临床结局相关（图2B）。我们进一步探究了39个枢纽基因与T细胞浸润的关联，发现VAMP5、TIGIT、LCK、CD27和CACYBP与T细胞浸润呈显著相关（图2C）。

(A) 森林图展示单因素Cox回归分析结果。其中Cox回归P值小于0.05的基因为 VAMP5、TIGIT、LCK、CHORDC1、CD27、CACYBP、PARP1和PRR13。

(B) 接受免疫治疗的膀胱癌患者的KM生存曲线。其中K-M分析P值小于0.05的基因为VAMP5、TIGIT、LCK、CHORDC1、CD27和CACYBP。

(C) IMvigor210队列中T细胞浸润水平与39个枢纽基因的相关性分析。

图三：TstcSig特征构建

选取了五个与生存预后和T细胞浸润相关的肿瘤特异性T细胞基因，构建了TstcSig特征（图3A）。

A) 韦恩图展示与免疫治疗患者预后及T细胞浸润相关的5个枢纽基因。

(B) 高、低评分组间ESTIMATE评分、免疫评分、基质评分及肿瘤纯度的差异比较。

(C) 热图显示基于TIMER、xCell、quanTIseq和MCPcounter四种算法分析的IMvigor210免疫治疗队列肿瘤微环境各免疫细胞浸润丰度。

(D) 高、低评分组间免疫检查点表达水平的比较。 p值<0.0001。

(E) 热图显示IMvigor210队列中肿瘤特异性T细胞特征与已知基因特征的相关性。

图四：功能富集分析结果

基于IMvigor210队列中高、低TstcSig组间所有基因的 fold change 值进行了基因集富集分析（GSEA），以识别具体富集的通路。

在高TstcSig组中，包括免疫应答的激活、免疫应答中的T细胞活化以及PD1阻断癌症免疫治疗在内的免疫反应相关通路均显著上调（图4A-C）。

图五：TstcSig预测免疫治疗反应

(A) TstcSig能够有效预测膀胱癌的免疫治疗反应，其背后与更有利的肿瘤免疫微环境和高肿瘤免疫原性密切相关。

(B) 在IMvigor210队列中，免疫治疗应答组的TstcSig评分显著高于无应答组。

(C) 较高的TstcSig评分与患者更长的生存期呈正相关。

(D-H) TstcSig与特定的免疫表型及PD-L1在免疫细胞和肿瘤细胞上的表达显著相关，这为免疫检查点抑制剂发挥作用创造了条件。高TstcSig组拥有显著更高的肿瘤突变负荷（TMB） 和肿瘤新抗原负荷（TNB）

图六：TstcSig的独立队列验证

分析另外两个免疫治疗队列，包括一个膀胱癌队列和一个黑色素瘤队列。在这两个队列中，较高的TstcSig评分均与更好的免疫治疗临床应答和更佳的临床结局相关（图6A-H）。这些结果强化了TstcSig与免疫治疗反应之间的关联。

图七：与109种T细胞特征的比较

在评估了TstcSig的预测价值后，有必要将其与其他T细胞特征在预测免疫治疗患者预后方面的性能进行比较。我们收集了109种T细胞特征（补充文件1），并在三个免疫治疗队列中针对总生存期进行了单因素Cox回归分析。

图7A-C：在所有免疫治疗队列中，仅有TstcSig和Exhaust_3_Feldman特征是独立的预后因素。

图7D：KM 分析显示，只有TstcSig和Exhaust_3_Feldman特征在所有队列中均保持一致的显著性。

图八：单细胞验证TstcSig与T细胞浸润的相关性

在四类免疫细胞中，T细胞簇的TstcSig评分最高（图8D）。比较应答者与无应答者的TstcSig评分发现，应答者来源的T细胞具有显著更高的TstcSig评分（图8E）。

(A) GSE145281注释结果UMAP图。

(B) 点图显示不同细胞类型的标志基因表达情况。

(C) 条形图展示应答与非应答患者不同细胞簇的比例分布。

(D) 小提琴图显示T细胞、NK细胞、B细胞和髓系细胞簇的TstcSig评分分布。

(E) 小提琴图展示GSE145281队列中TstcSig评分与免疫治疗反应的关联。R：应答者；NR：无应答者。*** p < 0.001

图九：空间转录组数据集（GSE171351）验证结果

分析显示，TstcSig与肿瘤微环境（TME）中的T细胞浸润呈正相关（图9A-D）。T细胞的TstcSig评分显著高于其他细胞类型（图9E）。(F-G) 箱式图分别显示TstcSig评分与NeoTCR4 (F) 和NeoTCR8 (G) 特征评分的相关性。

图十：TstcSig的泛癌预后分析

分析了TCGA数据库中涵盖33种肿瘤类型的10,327个肿瘤样本的RNA-seq数据（图10A）。

结果显示TstcSig水平存在显著异质性，其中DLBC等癌症呈现较高TstcSig水平，而KICH则水平较低（图10B）。

TstcSig在33种癌症类型中与T细胞浸润呈正相关（图10C）。

TstcSig在UCEC、OV、CESC、SKCM和HNSC中为保护因素，而在KIRP和UVM中则为风险因素（图10D）。

TstcSig与KIRP和UVM的不良预后相关，而与UCEC、CESC、SKCM和HNSC的良好预后相关（图10E）。

图十一、十二：实验验证

蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光实验表明：枢纽基因CD27在这些肿瘤特异性T细胞中表达上调（图11A-B）。

qRT-PCR结果显示：肿瘤特异性T细胞中CD27、CXCL13、IFNG和GZMB的表达均显著上调（图11C）。

流式细胞术检测了肿瘤特异性T细胞中IFN-γ、GZMB和PD1的表达水平。结果显示IFN-γ、GZMB和PD1在肿瘤特异性T细胞中均显著上调（图12A-G）。与PD1-肿瘤特异性T细胞相比，PD1+肿瘤特异性T细胞分泌更多的IFN-γ（图12H）。

小结

总之，本研究利用单细胞多组学数据开发并验证了一种新型肿瘤特异性T细胞特征（包括VAMP5、TIGIT、LCK、CD27和CACYBP），作为接受免疫治疗的膀胱癌患者的预后生物标志物。

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