单细胞转录组学分析揭示食管小细胞癌的上皮和微环境异质性

Single-cell transcriptomic analysis reveals epithelial and microenvironmental heterogeneity in small cell carcinoma of the esophagus 要想创新，得研究亚型啊，就只测了三个单细胞样本，加上两个公共数据集的分析，直接就干到一区了。

文献概述

背景：食管小细胞癌（SCCE）是一种罕见且侵袭性强的恶性肿瘤，治疗选择有限，预后较差。临床标本的缺乏和缺乏成熟的实验模型阻碍了对其细胞异质性和肿瘤微环境的全面了解。

方法：对SCCE样本进行了单细胞RNA测序，并将其与来自食管鳞状细胞癌（ESCC）、食管腺癌（EAC）以及来自ESCC和EAC病例的邻近正常组织（NT）的公开可用的scRNA-seq数据集整合（从GSE145370数据集中获得了7个ESCC肿瘤及其配对的NT样本，而从GSE222078数据集中获得4个EAC肿瘤和2个NT样本）。综合转录组学分析以识别细胞类型、推断恶性状态、分化轨迹、评估免疫景观并研究成纤维细胞亚型和细胞-细胞通讯网络。

结果及结论：SCCE肿瘤的特征是恶性上皮细胞占主导地位，并表现出严重的免疫抑制表型，免疫浸润减少，免疫检查点基因广泛下调。恶性上皮细胞表现出明显的染色体不稳定性，并被分为三种转录不同的亚型，具有不同的分化轨迹。肿瘤微环境具有复杂的基质区室，富含细胞外基质成纤维细胞（eCAF），其特征是ELF3调节活性升高，胶原蛋白驱动的信号传导主要由炎症CAF（iCAF）介导。SCCE还显示出食管癌亚型中最复杂的细胞-细胞通讯网络。

文献内容

1.跨组织学亚型食管组织的单细胞转录组学景观

针对四种组织学类型的综合单细胞RNA测序分析：NT、EAC、ESCC和SCCE。与其他亚型相比，SCCE样本显示上皮细胞显著富集，免疫群体较少。SCCE显示出上调和下调基因的独特模式。

2.恶性上皮细胞鉴定和功能表征

使用来自NT的上皮细胞作为参考进行inferCNV分析。SCCE中明显的CNV，其特征是广泛的染色体扩增和缺失，与EAC和ESCC中观察到的更温和的改变形成鲜明对比。SCCE上皮细胞表现出明显高于EAC和ESCC的CNV评分。密度图显示SCCE中CNV评分的分布更广泛且双峰，表明染色体改变的瘤内异质性更大。对SCCE中最常扩增的基因组区域的进一步分析确定了19号染色体是主要位点，具有跨越多个基因的广泛扩增信号。

恶性和非恶性上皮细胞之间存在明显的分离。表现出高CNV负荷和与高CNV参考亚群的强相关性的细胞被归类为恶性，恶性细胞表现出明显高于非恶性细胞的CNV评分。SCCE细胞在上皮间充质转化、增殖和血管生成方面表现出显著更高的评分。SCCE中的抗原呈递评分显著降低，表明抗原呈递能力受损。SCCE内CNV评分与EMT呈正相关，但与抗原呈递能力呈负相关。

SCCE细胞在与有丝分裂纺锤体、血管生成和EMT相关的通路中表现出显著的富集。

为了进一步验证SCCE的神经内分泌并研究相关调控途径，使用典型NE标记物（包括ASCL1、NEUROD1、NKX2-1、INSM1、CHGA、CHGB、NCAM1和SYP）计算了 NE 特征评分。与EAC和ESCC相比，SCCE表现出显著升高的NE评分，强化了其独特的小细胞样表型。评估与NE分化和肿瘤进展密切相关的信号通路Wnt、Notch和Hippo通路的活性。

3.SCCE恶性上皮细胞分子异质性的深入表征

恶性上皮细胞聚类为九个亚群。EMT，增殖，CNV和抗原呈递四个关键生物学评分的热图揭示了不同簇的不同功能模式，允许分类为三种分子状态：α（簇 2、4、6）、β（簇 1、5、7、8）和γ（簇 0、3）。α：高EMT和中度增殖评分；β：EMT评分较高，但抗原活性较低，γ：增殖和CNV评分升高，抗原呈递能力最低。TP63、JUNB、FOS和FOSL2等几种Wnt相关TF在β态下表现出优先活性。小提琴图进一步突出了在每种状态下优先活跃的代表性TF。根据转录和调控谱，ASCL1、POU2F3和NEUROG3分别被鉴定为α、β和γ状态的代表性标记。定义了SCCE的三种分子表型：SCCE_N（NEUROG3+）、SCCE_P（POU2F3+）和SCCE_A（ASCL1+）。

4.轨迹分析揭示了SCCE上皮细胞不同的分化途径和分子程序

SCCE_P细胞集中在根部，表明该亚型可能代表一个共同的祖细胞样群体。相比之下，SCCE_N细胞和SCCE_A细胞占据不同的末端分支，对应于不同的分化轨迹。

POU2F3在根部高度表达，而NEUROG3和ASCL1分别向SCCE_N和SCCE_A端表现出分支特异性上调。SCCE中的恶性上皮细胞起源于祖细胞样SCCE_P状态，并沿着两种不同的分化轨迹发散，从而产生具有独特转录谱和功能程序的SCCE_N和SCCE_A亚型。

5.免疫景观分析揭示了SCCE中独特的淋巴和骨髓重塑

CD4_Trm细胞在SCCE中显著富集，而CD4_Treg细胞和CD8_Tem细胞相对减少。CD4_Treg细胞表现出升高的调节评分，NK细胞表现出增强的细胞毒性活性，CD8_Tex细胞表现出明显的耗竭。对28个常用研究的免疫检查点基因的表达谱显示，SCCE中存在广泛的下调，大多数检查点配体和受体在几乎所有T/NK亚群中均以低水平表达。

SCCE中的M1巨噬细胞显著减少，肥大细胞和中性粒细胞显著增加，肥大细胞构成SCCE中最丰富的亚群。巨噬细胞中多种免疫途径的强烈富集，特别是在M1样细胞中，包括与炎症，抗原呈递和干扰素反应相关的途径。M1巨噬细胞中的M1和炎症评分升高，cDC中的抗原呈递能力增加。SCCE的免疫检查点表达总体下调和多种亚型的ESCC样品中相对较高的表达水平。

6.SCCE基质中成纤维细胞异质性和ELF3相关转录特征

无监督聚类确定了三种不同的成纤维细胞亚型，即肌成纤维细胞CAF（myCAF）、炎症CAF（iCAF）和细胞外基质CAF（eCAF）。eCAF在EAC中不存在，在ESCC中几乎检测不到，但在SCCE中显著富集。iCAF存在于所有三组中，在EAC中比例最高，而myCAF在ESCC中占主导地位。eCAF在SCCE中成纤维细胞的比例显著更高，突出了疾病特异性扩展。

在SCCE中，排名最高的转录因子包括E2F1、ELF3、ATF6B、CREB3L1和ATF6。在eCAF子集中，ELF3也出现在基于RSS的前五名转录因子之列。此外，ELF3在eCAFs中按转录活性评分（RAS）排名前20位，进一步凸显了其突出性。ELF3在eCAF中显著升高，在SCCE样本中最为明显。ELF3靶基因的功能富集分析揭示了与癌症相关途径的关联，包括钙粘蛋白结合、GTP酶活性的调节和激酶信号传导，强调了其在成纤维细胞介导的肿瘤行为中的潜在作用。

7.SCCE表现出以胶原信号传导和iCAF介导的相互作用为主的独特细胞间通讯模式

EAC和ESCC表现出相对集中的相互作用模式，而SCCE显示出更广泛和均匀分布的细胞间信号传导。从定量上看，SCCE在三组中表现出最多的相互作用数量和最大的累积相互作用强度。配体-受体对的比较分析表明，SCCE表现出最多的总相互作用。SCCE富集的相互作用主要涉及COL6A/COL1A配体和SDC1/SDC4受体的多种组合，表明该亚型中具有不同的配体-受体特征。

胶原信号级联是SCCE中最突出的细胞间通讯轴，其次是APP，FN1和MIF信号传导。iCAFs可能是参与胶原蛋白介导的细胞间信号传导的细胞外基质成分的主要来源。