动物物种鉴定—使用NCBI工具Primer-BLAST设计qPCR引物

动物物种鉴定—使用NCBI工具Primer-BLAST设计qPCR引物

最近遇到一个项目，大概是检测一块组织，如牛 (Bos taurus)中，是否含有羊 (Ovis aries)、猪 (Sus scrofa)、鸡 (Gallus gallus)、鸭 (Anas platyrhynchos)的等可疑掺杂源。

方法是使用pcr或qPCR，区分如下

• 普通终点PCR（凝胶）：能做物种存在/不存在的快速筛查，成本低，但灵敏度和定量能力受限；加工肉（高温/腌制）DNA降解时，长片段靶标容易失效。
• qPCR（实时荧光）：灵敏、特异、可定量/半定量（Ct 值可用于判断含量范围），适合监管/鉴定。很多研究报告对猪/鸡/鸭的qPCR LOD 能做到检测到几十拷贝甚至更低、或检测到0.1%（w/w）水平。

对于动物物种的鉴定，选择线粒体基因组中的COI（cytochrome c oxidase I）作为 qPCR 的靶区。

• 优点：COI 是常用的 DNA 条形码，线粒体拷贝多，灵敏度高，已有大量序列可供比对与引物设计。用于多种动物的 qPCR/鉴定研究很常见（且有专门的 mini-COI 用于加工食品）。
• COI 基因的种间差异大，种内差异小，COI（线粒体基因）是 DNA 条形码标准基因；不同动物间差异通常在 10–20%，而同种个体差异仅 0.1–1%；因此完全能找到每个物种独有的碱基差异区段。
• 备选靶标：cytochrome b (cyt b)、12S rRNA、ND2/ND4 等线粒体基因也常用；某些研究偏好 cytb 或 12S 以避免 COI 中的区域存在较多同源性或 NUMTs 的风险。选择时以“易于设计出特异短片段且在 BLAST 上不交叉”为准。

1.COI基因序列确定

• NCBI中检索某物种线粒体基因组序列（官方认定），以牛 (Bos taurus)为例，可在NCBI Nucleotide(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中检索

"Bos taurus"Organism AND (mitochondrionTitle OR mitochondrialTitle) AND "complete genome"Title

• 当然也可以让chatgpt和deepseek直接帮你找合适的accession id，但是一定要自己审核一下。AI工具可能出错
• 以牛 (Bos taurus)的NC_006853.1为例，可以在NCBI中直接检索NC_006853.1，在其中页面中检索COX1,也就是COI基因，确定COI基因的位置，如在5687-7231bp

页面中点击FASTA，点击Change region shown，输入5687-7231bp，点击update view，即可以确定COI序列

• 按照以上方法确定各物种COI基因位置

2.使用Primer-BLAST根据COI基因序列设置qPCR引物

• 引物设计时候，chatgpt推荐在设计前先做多序列比对，但是这一步我没有做了，直接进行的引物设计

• 可以在当前页面直接跳转到Primer-BLAST设计页面（也可以在NCBI首页，点击blast，在页面下方可以找到Primer-BLAST）

• 勾选以下参数，因为是DNA层面的检测，不是确定某个基因具体的mRNA表达量，所以Database这一栏选择R efseq representative genomes,而不是refseq mRNA

• 获取引物序列，共返回10对引物，可综合考虑，选择一对
• 产物长度 (bp)： 70–150 bp 是 qPCR 理想范围；越短越好（一般 70–120 bp）
• Tm 值：相差 <2°C 为理想
• GC 含量 (%)：在 40–60% 范围内
• Self complementarity：越低越好（<6）
• Self 3' complementarity：越低越好，低 3' 自互补性更安全（防止引物二聚体）

3.使用Primer-BLAST检测引物的特异性

• 选择好引物后，可以在进行验证下（如果是从文献中copy的引物，使用前也可以进行验证下），直接在Primer-BLAST页面，把模版空着，输入对应的引物即可
• 也可以在Organism这一栏中限定物种，如本次试验中，可以限定所关注的这些物种

参考教程：https://www.bilibili.com/video/BV1Bv4y1277k/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=7e83cb2510516bdff59ccf808d022aa0