MSP甲基化引物设计

MSP甲基化引物设计

1.前置知识点

1.1 实验原理

• DNA 甲基化是发生在CpG二核苷酸位点胞嘧啶上的一种重要表观遗传修饰，启动子区域的CpG甲基化通常与基因转录沉默密切相关。然而，甲基化修饰并不会改变DNA的碱基配对，因此需要借助亚硫酸氢盐处理将这种修饰转化为可检测的序列差异。
• 其原理是：在亚硫酸氢盐作用下，未甲基化的胞嘧啶会发生脱氨基反应并最终被转化为尿嘧啶，在随后的PCR扩增中被识别为胸腺嘧啶；而甲基化的胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶）对亚硫酸氢盐处理稳定，不发生转化，仍保持为胞嘧啶。这样，同一DNA区域在经过处理后，如果处于甲基化状态则保持“C”，若未甲基化则变为“T”。基于这一差异，可以设计两组特异性引物进行甲基化特异性PCR（MSP）：甲基化引物（M引物）保留“C”，仅能扩增甲基化模板；非甲基化引物（U引物）将该位点视作“T”，仅能扩增未甲基化模板。
• 通过PCR产物的有无即可判断样本的甲基化状态：若仅M扩增则为甲基化，仅U扩增则为未甲基化，二者皆扩增则提示部分甲基化或样本混合。由此，亚硫酸氢盐处理结合MSP技术，成功地将不可见的表观遗传修饰转化为可检测的序列差异，实现对基因甲基化水平的敏感检测。

1.2 CpG位点及CpG岛概念

• CpG 的含义
  • C = Cytosine（胞嘧啶），p = 磷酸二酯键（phosphodiester bond，连接 C 和 G 的“—p—”），G = Guanine（鸟嘌呤）
  • 所以 CpG 就是指：在 DNA 双链序列里，5'—C—p—G—3' 这种 线性相邻 的碱基组合
• CpG 的甲基化
  • 在哺乳动物基因组里，CpG 中的 C 常常会被修饰成 5-甲基胞嘧啶（5-mC）。这种修饰叫 DNA 甲基化，是一种重要的表观遗传修饰
  • 大部分基因组 CpG 位点都是甲基化的，但在启动子区域的 CpG 岛，甲基化状态对基因转录活性非常关键
• CpG 岛 vs CpG 位点
  • CpG 位点：就是单个 "CG" 二核苷酸位置
  • CpG 岛：指富含很多 CpG 位点的区域（>100bp，GC% > 50%，Obs/Exp > 0.6）。启动子常常含有 CpG 岛，甲基化状态决定基因是沉默还是表达

1.3 转录起始位点（TSS）和起始密码子

• TSS（转录起始位点）:RNA聚合酶开始合成mRNA前体（pre-mRNA）的第一个核苷酸位置。所在位置：在基因的5’非翻译区（5’UTR）中,标志着转录开始，不一定和蛋白编码序列的ATG重合,决定mRNA的起始位置
• ATG（起始密码子）:mRNA上用作翻译的第一个密码子，编码蛋白质的第一个氨基酸（甲硫氨酸，Met）。在mRNA的编码区（CDS）起始处,通常位于TSS下游若干碱基（距离可从几十到几百bp不等）,决定蛋白的起始位置

…---[启动子]---TSS(+1)---5’UTR---ATG（起始密码子）---…

1.4 为什么引物设计要在启动子区域？

• 在真核基因中，启动子区域是RNA聚合酶及多种转录因子结合的关键位点，直接决定了基因能否被转录。
• 当启动子区域存在CpG岛时，其甲基化状态对基因表达具有重要的调控作用：如果CpG岛甲基化，甲基结合蛋白会招募组蛋白去乙酰化酶等抑制复合物，使染色质结构紧密，从而阻止转录因子和RNA聚合酶结合，导致基因沉默；而未甲基化状态则有利于开放染色质结构，促进转录活性。
• 因此，启动子甲基化与基因是否“开关”直接相关。相较之下，如果在基因编码区或其他区域检测甲基化，其结果未必直接反映基因的转录水平，对功能解释意义有限。
• 基于此，研究基因的甲基化调控作用时，通常优先选择启动子区域，特别是靠近转录起始位点（TSS）附近的CpG位点进行引物设计和检测。

2.实际案例

2.1 启动子区域获取

• 本次以ESR1基因为例
• 关于如何获取基因的启动子区域，我先前在这篇文章中数据挖掘—NCBI中获取某基因序列和转录起始位点已经详细说明，之前的做法是找到起始密码子，然后把前2000bp左右的基因组序列作为启动子候选区，这种做法基本上可以覆盖到启动子
• NCBI中,检索ESR1基因，可以发现其存在多个转录本，一般以NM开头的为主
  • NM_000125.4：NM 开头 → mRNA参考序列（RefSeq mRNA），代表 ESR1 基因的成熟mRNA序列（含5’UTR、CDS、3’UTR）
  • NP_000116.2：NP 开头 → 蛋白质参考序列（RefSeq Protein）由上面的NM_000125.4 mRNA翻译而来的蛋白质序列
• 反应在基因组中的位置如下图，所以更为合理的做法找主转录本，如NM_000125.4 fasta序列，位于Ch6号染色体151,807,682bp位置，将其向前延伸2000bp位置作为ESR1候选启动子区域，即6号染色体151805682～151807682区域

2.2 使用MethPrimer预测引物

• 使用 MethPrimer（http://www.urogene.org/methprimer/），输入取到的2000 bp启动子序列，查看是否存在 CpG 岛（CpG dinucleotide 高密度区域），优先选择 靠近 TSS 的 CpG 岛作为检测区，因为甲基化通常在TSS附近最有功能意义：
  • 导入的2000 bp 序列中，1606–1861 bp 之间存在一个 CpG 岛
  • MethPrimer给出了两对引物：
    • M 引物对：用于扩增甲基化DNA模板（CpG 中的 C 保持不变）
    • U 引物对：用于扩增 非甲基化DNA模板（CpG 中的 C 被转化为 T）

#预测结果
Sequence Name: 
Sequence Length: 2001

CpG island prediction results
Criteria used: Island size > 100, GC Percent > 50.0, Obs/Exp > 0.60
 1 CpG island(s) were found in your sequence
            Size	(Start - End)
 Island 1   256 bp	 (1606 - 1861)

Primer picking results for methylation specific PCR (MSP)
   
   Primer            Start Size  Tm      GC%   'C's  Sequence
1  Left  M primer    1640   28   56.89   46.43   4  TAAATAGAGATATATCGGAGTTTGGTAC
   Right M primer    1811   25   53.18   56.00   8  CTAAATAAAAACTAAATTTCACGAC
   Product size: 172, Tm: 64.3
  
   
   Left  U primer    1639   30   57.19   46.67   4  ATAAATAGAGATATATTGGAGTTTGGTATG
   Right U primer    1812   26   52.13   57.69   9  ACTAAATAAAAACTAAATTTCACAAC
   Product size: 174, Tm: 63.3

• 位置：在你导入的2001 bp 序列中，1606–1861 bp 之间存在一个 CpG 岛。大小：256 bp（符合 CpG 岛的常见标准：长度 > 200 bp，GC% > 50%，Obs/Exp > 0.6）。意义：这个 CpG 岛靠近 TSS（通常功能相关），所以被 MethPrimer 选作引物设计区域。
• MethPrimer给出了两对引物：
  • M 引物对：用于扩增 甲基化DNA模板（CpG 中的 C 保持不变）
  • U 引物对：用于扩增 非甲基化DNA模板（CpG 中的 C 被转化为 T）

3.甲基化后序列

• 可以用在线工具，或自写R程序，模拟甲基化后序列
• 如在线工具：https://jingege.shinyapps.io/JinglePlots/

• 转换后的序列在snapgene中打开，可以完全匹配M引物对

参考教程：https://www.bilibili.com/video/BV1Nh4y1577V/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=7e83cb2510516bdff59ccf808d022aa0