【辰辉创聚生物】可溶性蛋白表达|大肠杆菌蛋白表达|蛋白表达纯化

大肠杆菌（Escherichia coli）作为最常用的原核宿主系统之一，在重组蛋白表达方面具有生长快、成本低、遗传操作简便等优点。然而，由于异源蛋白表达过程中常出现蛋白易聚集成包涵体、降解或表达水平低等问题，导致可溶性表达效率不高。因此，实现重组蛋白在 E. coli 中的可溶表达，是确保后续纯化、结构功能研究与应用的关键。

f13ccdeefd935d1036e76fd0547a7920

可溶性蛋白表达的背景与挑战

E. coli 表达系统是目前广泛使用的重组蛋白表达平台，具有成熟的遗传工具、可高密度培养、表达速率快、成本低廉等显著优势。但同时，不少异源蛋白在 E. coli 中表达时出现以下问题：

①．低表达或不表达，可能由启动子强度、mRNA 结构与稳定性、稀有密码子等引起。

②．表达的蛋白不溶，形成包涵体，影响活性，需复性。

③．蛋白毒性，对宿主生长造成抑制，影响表达。

④．蛋白降解，长时间表达或表达条件不当，宿主蛋白酶作用造成目标蛋白损耗。

因此，提升可溶性表达，对科研与产业都具有重要意义。

影响可溶性表达的关键因素

1．基因序列与 mRNA 设计

密码子偏好：E. coli 对某些密码子使用频率较低，若目标基因包含稀有密码子，会导致翻译停滞、错误或提前终止。通过密码子优化提高翻译速率与精确度，是常见做法。现代研究已超越简单的 CAI 优化，进一步考虑 tRNA 适应性指数（tAI）、归一化翻译效率（nTE）等综合参数。

mRNA 二级结构与 SD 区域可达性：强 mRNA 二级结构会阻碍核糖体结合，引起翻译起始困难。设计时需避免起始子附近形成稳定发夹结构，保证 mRNA 的可达性。

2．融合标签（Fusion Tags）

提高可溶性与折叠率：融合标签如 MBP（麦芽糖结合蛋白）、GST、Trx、SUMO、NusA 等，能够增强可溶性与正确折叠，并便于纯化。

标签位置与长度：通常放在 N 端，标签后加 TEV、SUMO、EK 等切割位点，诱导表达后可酶切去除标签。

3．表达载体与启动子

强启动子：如 T7 promoter（pET 系列载体）用于高水平表达，诱导诱导强，但容易导致过量蛋白聚集。

可调控表达系统：如 pLysS / pLysE 抑制启动前表达，有助于毒性蛋白表达。

自诱导培养系统：无需外加 IPTG，通过培养基成分自动诱导表达，可减轻表达压力并提高溶解性。

4．宿主菌株选择

经典表达株：BL21(DE3)、Rosetta（携带稀有 tRNA）、Origami、Shuffle（增强二硫键形成）。

耐毒性株：BL21(DE3)pLysS/pLysE 在诱导前抑制 T7 RNAP 表达，从而降低毒性蛋白对宿主的损害。

5．培养条件与诱导参数优化

诱导温度：较低温度（如 16–25 ℃）有助于缓慢折叠和可溶性表达，减少包涵体形成。

诱导时间与 IPTG 浓度：较低 IPTG（0.1–0.5 mM），延长诱导时间，常能提高溶解性。

培养方式：流加培养、高密度细胞培养、自诱导系统等，可以提高表达量同时保持可溶枝结构。

6．分泌表达途径

将目标蛋白导入周质空间或培养上清，可以利用较低蛋白酶活性和氧化环境有利于二硫键形成。常用信号肽如 PelB、OmpA、PhoA 等，经过 Sec、SRP 或 TAT 分泌通路实现导出。

7．探索性/高通量设计方法

数据驱动与机器学习工具：近日综述指出，SoluProt、ICOR、Cosmo、DeepTESR 等工具可用于预测表达可溶性并进行优化设计。

常见优化策略与实例

1. 融合标签辅助表达：GST 与 MBP 案例

科研人员在研究中发现，将 GST 融合到 SOD2 蛋白 N 端（GST-SOD2），在诱导温度为 25 ℃、添加辅助物条件下，提高了 SOD2 的可溶性表达量。调整诱导时间与温度后取得理想效果。

MBP 融合标签系统（如 NEB 的 NEBExpress MBP 系统）在超过 75% 的测试蛋白中实现了高可溶表达（产量高达 100 mg/L），并可通过亲和层析结合 TEV 酶切去标签，提高纯度并获得天然序列蛋白。

2. 融合标签与纯化标签融合提高表达量

专利中提到一种复合融合标签结构（T7 tag + His6 + Strep II + EK 切割位点），克隆到 N 端，经过密码子优化，表达量较常规 His 标签提高了约 4 倍，纯度提高了 40%。

3. 分泌表达：信号肽与分泌通路应用

通过优化信号肽（如 PelB、MalE）引导目标蛋白进入周质空间，减少蛋白酶降解并利于折叠。目前已有多个案例利用 Sec 或 SRP 通路实现二硫键依赖性蛋白的正确折叠与可溶性表达。

4. 培养条件优化

综述指出，结合低温诱导、自诱导培养、高密度发酵等方式可显著提高表达量与可溶性。

例如，可以采用自诱导培养基（含乳糖与甘油），不需 IPTG 自动诱导表达，菌体生长更缓和，蛋白质量更好；另外，高密度培养下诱导条件合适能产出更多可溶蛋白。

5. 宿主菌株选择与毒性控制

当目的蛋白对宿主具有毒性时，使用 pLysS / pLysE 系统抑制提前表达，或选用可调节表达强度的菌株（如 Lemo21），可减少毒害，提高最终表达量并保持活性与溶解性。

可溶性蛋白表达策略与建议流程

IMG_256

1. 基因设计

优化密码子（考虑 CAI、tAI、nTE 等综合指标）

检查 mRNA 二级结构，确保 SD 区清晰

添加 N 端信号肽或融合可溶性标签（如 MBP）

2. 构建表达载体

选择合适载体（如 pET 系列）；融合标签后设置切割位点（TEV/SUMO/EK）

准备多种版本（有/无标签）

3. 选择宿主菌株

例如 BL21(DE3)（表达量高）、Rosetta（稀有 tRNA）、Shuffle/Origami（二硫键蛋白）

若毒性蛋白，选 pLysS / pLysE 抑制提前表达

4. 优化表达条件

温度：16–25 ℃ 低温诱导

IPTG 浓度：0.05–0.5 mM，或采用自诱导培养

诱导时间：4–20 h，适当延长

培养方式：摇瓶 vs 发酵罐（高密度）

5. 表达溶解性检测

细胞破碎后离心，取上清与沉淀分析 SDS–PAGE 比较溶解和包涵体表达的比例

6. 纯化与活性检测

利用亲和层析、切割标签、二级纯化（如凝胶层析）纯化

检测生物活性、折叠结构（如圆二色、活性实验）

7. 数据反馈与迭代

若可溶性低，可尝试改变标签类型、温度、诱导策略、培养方式或宿主菌株

可结合机器学习工具预测和设计表达方案，提高效率

提高重组蛋白在 E. coli 中的可溶性表达是蛋白功能研究、结构分析与应用开发的基础。未来，随着多组学与 AI 工具的进一步发展，可望实现更快速、高通量、准确地预测与实现可溶性表达，尤其在复杂、膜相关、极度毒性或需复杂修饰蛋白的表达方面，将发挥更大作用。