【辰辉创聚生物】重组蛋白表达纯化:毕赤酵母蛋白表达系统全解析

毕赤酵母（Pichia pastoris，又称 Komagataella）作为一种广泛应用的真核表达系统，兼具高表达水平、成本低廉、高密度发酵能力及复杂翻译后修饰能力，特别适合生产具有正确折叠和修饰的重组蛋白。

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毕赤酵母表达系统的优势

1. 真核特点与高产能力

毕赤酵母具备真核细胞的翻译后修饰能力，如二硫键形成、糖基化及正确折叠，显著优于大肠杆菌表达系统。其强启动子（如 AOX1）可实现高水平表达，而高密度发酵使其可达到每升克级产量。此外，该系统宿主分泌内源蛋白少，便于纯化。

2. 纯化简便

毕赤酵母表达的目标蛋白可通过分泌表达释放到培养上清，减少破碎细胞所导致的杂质，降低对 His-tag 等亲和标签的依赖。同时，宿主分泌蛋白含量低，有利于下游纯化流程。

影响蛋白表达水平的关键因素

1. 外源基因拷贝数

提高外源基因拷贝数通常可增强蛋白表达，但极高拷贝可能引发宿主代谢负担，甚至抑制增长与表达，因此需要优化筛选。

2. 密码子优化与基因序列设计

毕赤酵母存在密码子偏好性，需通过密码子优化提升表达效率。同时，近年来 CRISPR/Cas9 技术的发展，使基因编辑与拷贝数控制更为精准。

3. 启动子选择

AOX1 启动子是最常用的甲醇诱导型启动子，表达水平极高。但其依赖甲醇，存在安全与操作风险，近年来常表达型启动子（如 GAP、PGK）逐渐被采用，作为更安全稳定的替代。

4. 信号肽与分泌路径

选择适配的信号肽（如 α-factor）可有效引导重组蛋白分泌，提升纯化便利与表达水平。

5. 分子伴侣与折叠机制

对于难折叠蛋白，可通过分子伴侣共表达（如 PDI、BiP）帮助其正确折叠。

毕赤酵母蛋白表达优化策略及系统提升

优化载体与菌株：通过高拷贝整合和筛选耐受宿主菌株，提升表达效率。

发酵工艺控制：优化碳源供给、溶氧水平和温度，提升细胞密度。

基因编辑与系统生物学：CRISPR 技术结合代谢建模，有助于识别瓶颈并精准优化表达。

目标蛋白纯化流程建议

1. 构建表达系统：合理选择启动子、信号肽和密码子优化。

2. 筛选高产菌株：通过抗性筛选或 qPCR 检测拷贝数。

3. 优化发酵条件：精确控制甲醇进料和温度。

4. 分泌上清收集：离心、过滤并进行缓冲交换。

5. 初步纯化：采用离子交换或疏水层析。

6. 亲和层析：His-tag/Ni-NTA 常用，必要时可去除标签。

7. 质量验证：通过 SDS-PAGE、电泳及活性检测确认纯度。

膜蛋白在毕赤酵母系统中的表达与纯化

膜蛋白（如 GPCR、离子通道、转运体）在结构生物学和药物研发中具有核心地位。但膜蛋白疏水性强、折叠复杂，导致：①、表达水平低；②、易发生错误折叠或降解；③、纯化需特殊条件维持稳定。

1. 毕赤酵母表达膜蛋白的优势
2. 真核折叠环境：能形成正确的跨膜拓扑结构。
3. 高密度发酵：提高总体产量，弥补单细胞产量不足。
4. 灵活调控：可利用分子伴侣共表达与脂质调控提升折叠质量。
5. 膜蛋白表达优化策略

启动子调控：AOX1 虽强，但过量表达会诱导内质网应激，弱启动子（GAP、PGK）更适合部分膜蛋白。

伴侣蛋白共表达：Hsp70、PDI、BiP 等有助于跨膜折叠与稳定。

低温诱导：降低至 20–25 ℃ 可减轻错误折叠，改善膜蛋白功能性。

膜环境优化：调节宿主脂质组成，或在培养基中添加胆固醇前体以提升稳定性。

1. 膜蛋白表达纯化流程

膜蛋白表达纯化

①. 细胞破碎：高压破碎或玻璃珠震荡，释放膜系统。

②. 膜组分分离：超速离心收集膜馏分。

③. 去垢剂提取：采用温和去垢剂（如 DDM、LMNG）保持结构。

④. 亲和层析：利用 His-tag、FLAG-tag 或 Strep-tag 实现分离。

⑤. 稳定化重构：常用脂质体或纳米盘技术（nanodiscs），保持天然活性，利于功能检测和冷冻电镜结构解析。

毕赤酵母兼具真核系统的修饰能力与工业化可扩展性，是重组蛋白尤其是复杂膜蛋白的有力表达平台。尽管仍面临拷贝数负担、折叠压力和甲醇安全性等问题，但随着代谢工程、伴侣蛋白调控和发酵工艺优化的发展，其在结构生物学、药物研发及工业生产中的应用将更加广泛。