Sentieon项目文章 | 肿瘤突变负荷与纳武利尤单药治疗及其联合伊匹木单抗在小细胞肺癌中的疗效研究

关键词：TMB；SCLC；WES；

引言

肿瘤突变负荷（TMB）作为预测免疫检查点抑制剂疗效的生物标志物在多种实体瘤中显示出潜力，但其在小细胞肺癌（SCLC）中的作用尚不明确。SCLC通常具有高TMB，但缺乏有效的预测性生物标志物，而常用的PD-L1表达在SCLC中罕见且与疗效无关。

尽管纳武利尤单抗（抗PD-1）单药或联合伊匹木单抗（抗CTLA-4）在复发性SCLC中显示出持久的反应和生存获益，但如何精准识别最可能从治疗中获益的患者，特别是区分单药治疗与联合治疗（后者毒性风险更高）的适用人群，是临床上面临的关键挑战。现有的生物标志物PD-L1在SCLC中预测价值有限。

为此，研究者利用全外显子测序（WES）技术，评估了TMB对纳武利尤单抗单药或联合伊匹木单抗在SCLC队列患者中疗效的影响。研究将患者按TMB分为低、中、高三组，旨在明确TMB与客观缓解率（ORR）、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的关系，并探索其在指导单药或联合治疗选择中的价值。研究证实高TMB是SCLC免疫治疗疗效的关键预测因子，为SCLC的个体化免疫治疗提供了分子依据。

图1 文献介绍

今天的文献解读专栏给大家带来的是2018年发表在cell期刊的：“ Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer”。

材料与方法

样本与实验设计

样本

研究对象为经组织学或细胞学确诊的局限期或广泛期小细胞肺癌（SCLC）患者，均在接受至少一种含铂化疗方案后出现疾病进展。患者来源为多中心临床试验（CheckMate 032），均满足以下的标准：

1. 年龄≥18岁，ECOG体能状态评分0或1分；
2. 不限PD-L1表达水平及铂类敏感性（复发时间≥90天）或耐药性（复发时间<90天）；
3. 需提供基线或研究期间肿瘤活检样本（4例患者使用研究期间活检样本替代基线样本）。

共纳入401例患者，分属非随机化与随机化队列，使用纳武利尤单抗单药组共245例，其中非随机化为98例、随机化为147例；纳武利尤单抗+伊匹木单抗组共156例，非随机化为61例，随机化为95例；共有211例（53%）患者成功完成肿瘤突变负荷（TMB）评估。

实验设计

试验类型：多中心、多臂、开放标签的Ⅰ/Ⅱ期临床试验。

治疗方案：

单药组：纳武利尤单抗（3 mg/kg，每2周静脉注射）；

联合组：纳武利尤单抗（1 mg/kg）+伊匹木单抗（3 mg/kg，每3周×4周期），后用纳武利尤单抗单药维持（3 mg/kg，每2周）。

图2 患者分析流程图

治疗持续：直至疾病进展（RECIST v1.1标准）或出现不可耐受毒性，允许符合条件者进展后继续用药。

终点设置

主要终点：客观缓解率（ORR），经盲态独立中心审查确认（RECIST v1.1标准）。

次要终点：总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）。

肿瘤评估：

基线：CT/MRI全面评估；

治疗期间：前24周每6周一次，此后每12周一次，直至进展或治疗终止。

生存监测：

治疗期：持续监测；

停药后：每3个月随访至死亡或研究结束。

全外显子组捕获与测序

肿瘤DNA从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中经Allprep DNA/RNA试剂盒分离；胚系DNA从全血中通过QIAamp DNA Blood Midi Kit提取。

150 ng基因组DNA经Covaris仪器片段化至~150 bp，磁珠纯化后使用Agilent SureSelectXT试剂盒进行末端修复和接头连接，经6轮PCR扩增。

将500 ng富集文库与 SureSelect All Exon v5探针杂交，纯化后经11轮PCR扩增。文库在 Illumina HiSeq 2500平台使用2×100 bp进行双端测序，肿瘤样本平均覆盖深度103×，胚系样本104×。

比对与组装

使用使用BWA(0.7.15版本)进行初始比对，Sentieon BWA（201704.01）去除重复序列、重比对和BQSR，并对配对样本进行共同重比对。

测序质量控制

使用Sentieon质量控制算法（基于Picard指标）计算流动池循环的平均碱基质量、碱基质量分数分布、GC偏差、比对率和插入片段大小。

基于Agilent SureSelect v5靶向bed文件,使用CollectHsMetrics 收集比对reads的关键指标、平均覆盖度、>20×碱基百分比及其他指标。

最后，使用BAM-matcher比较肿瘤和血液文件，确保来自同一患者，并检查是否存在样本互换。若未通过质量控制（总reads＜45,000,000、平均靶向覆盖度＜50X、或20X＜碱基百分比＜80%）及配对样本间的基因型匹配度＜0.85则将被剔除。

突变检测与注释

使用Sentieon TNsnv检测体细胞单核苷酸突变，Strelka(v1.0.15)检测单核苷酸突变和插入缺失，来识别存在于肿瘤的特定变异。对突变检测生成的文件进行严格过滤，仅保留通过内部质控标准的变异，用 snpEff（v4.1c） 进行注释。进一步排除常见多态位点（dbSNP、ExAC数据库），但保留与COSMIC数据库重叠的变异。

图3 Sentieon的作用

肿瘤突变负荷的确定

基于配对的肿瘤-血液样本来确定肿瘤突变负荷(TMB)，定义为经过筛选后的体细胞错义突变总数。对于多个合格样本的患者，采用平均值计算TMB。但检测在研究实验室进行，不属于CLIA认证的临床诊断测试。

在分析TMB与治疗效果的关系时，采用了三分位数、中位数和四分位数等多种分组方式，并进行了以TMB为连续变量的ROC分析。研究还整合了既往100例SCLC患者的全基因组测序数据，这些患者均具有配对的肿瘤-正常组织测序结果、分子数据和生存期信息。

统计分析基于原始治疗分配进行，用Kaplan-Meier法估计生存期，用Clopper-Pearson方法计算反应率及其95%置信区间，所有分析均在R 3.4.1版本中完成。

研究结果

研究首先建立了TMB分析的标准化流程：采用配对肿瘤与血液样本进行WES，定义TMB为体细胞错义突变总数，并按三分位法将患者分为低（<143个突变）、中（143-247个突变）和高（≥248个突变）TMB组。在401例患者中，211例（53%）成功完成TMB评估，其基线特征与整体队列一致，具有代表性。

TMB与客观缓解率（ORR）显著相关

高TMB患者接受纳武利尤单抗单药的ORR为21.3%，联合治疗组达46.2%，显著优于低TMB组的4.8%和22.2%，以及中TMB组的6.8%和16.0%。结果显示联合治疗在所有TMB分组中均优于单药，且在高TMB组差异最显著。

还比较了SCLC和NSCLC中ORR与TMB的关联。两种癌症中TMB与纳武单抗ORR间关联的ROC曲线相似，表明肿瘤突变负荷是这两种患者群体对纳武单抗反应的预测因子。

图4 按肿瘤突变负荷三分位数分组的客观缓解率

生存获益集中于高TMB人群

在无进展生存期（PFS）中，高TMB患者联合治疗的1年PFS率达30.0%，显著高于单药组的21.2%及中TMB组的3.1%和8.0%、低TMB组的不可计算和6.2%。

图5 按治疗方式和肿瘤突变负荷三分位数分组的无进展生存期 CI表示置信区间。

在总生存期（OS）中，高TMB患者联合治疗的1年OS率高达62.4%，较单药组的35.2%提升近一倍，而低TMB组两种方案OS无显著差异。

图6 按治疗方式和肿瘤突变负荷三分位数分组的总生存期 CI表示置信区间。

在高肿瘤突变负荷患者中，联合治疗的1年PFS和1年OS高于单药治疗；而在低肿瘤突变负荷患者中，两种治疗方案间的PFS和OS没有实质性差异。

图7 各患者最佳总体反应的肿瘤突变负荷分布 箱线图中的黑线表示中位数。箱体的底部和顶部分别表示第一和第三四分位数。下方的须线表示四分位距的1.5倍以下的第25百分位数或数据集的最小值(取较大值)。上方的须线表示四分位距的1.5倍以上的第75百分位数或数据集的最大值(取较小值)。

TMB的预测特异性

在未接受免疫治疗的独立SCLC队列中，TMB与生存期无预后关联，证实其作为免疫治疗特异性预测标志物而非普遍预后指标的价值。

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讨论

图8 文献讨论

TMB与治疗响应的关联机制

首次证实TMB作为SCLC免疫治疗效果预测的关键生物标志物。研究显示，高TMB患者(≥248个错义突变)在接受纳武利尤单抗联合伊匹木单抗治疗时，ORR达46.2%，1年OS提升至62.4%，远优于低/中TMB组。值得注意的是，TMB的预测价值独立于PD-L1表达，该发现与既往在其他癌种中的研究结果一致，表明TMB可能是跨癌种的免疫治疗通用生物标志物。

治疗策略的精准选择

TMB分层为临床决策提供了重要依据。对于高TMB患者，联合治疗方案显著优于单药治疗，1年无进展生存率提高近3倍。而对于中低TMB患者，单药治疗与联合治疗的生存获益差异不大，考虑到联合方案的毒性风险更高，单药治疗可能是更安全的选择。

技术可行性与临床转化挑战

尽管研究取得了重要进展，但仍面临一些技术挑战。研究中成功在61%的患者中获取配对肿瘤-血液样本，其中86%完成了TMB评估。然而，研究存在回顾性分析的固有偏差，需要在前瞻性试验中进行验证。

总结

本研究首次证实TMB可指导SCLC免疫治疗分层，为缺乏有效生物标志物的SCLC领域带来突破，并推动肺癌免疫治疗向精准化迈进。