单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）的应用与试验基本步骤

单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）的应用与试验基本步骤

彗星实验（Comet Assay），又称单细胞凝胶电泳实验（Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE），是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的灵敏技术。该技术由Östling和Johanson于1984年首次提出，后经Singh等人改进，现已成为遗传毒理学、环境监测、生物医学研究等领域的重要工具。

彗星实验

彗星实验的作用

检测DNA损伤：评估细胞在各种条件下（如化学物质、辐射、环境污染物等）的DNA损伤程度

研究DNA修复机制：通过时间序列实验观察DNA损伤后的修复过程

评估遗传毒性：用于药物开发、化妆品安全评估等领域的遗传毒性测试

环境监测：评估环境污染物对生物体的遗传毒性影响

临床研究：研究疾病（如癌症）与DNA损伤的关系

彗星实验的基本步骤

1. 样品制备

收集待测细胞（可以是培养细胞、血液淋巴细胞、组织细胞等）

制备单细胞悬液（浓度约1×10⁵ cells/mL）

细胞活力检测（建议>80%）

2. 包埋

将细胞与低熔点琼脂糖（0.5-1%）混合

滴加在预先涂有普通琼脂糖的载玻片上

盖上盖玻片，4℃固化5-10分钟

3. 裂解

去除盖玻片，将载玻片浸入裂解液（含2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, 1% Triton X-100, pH 10）

4℃裂解1-2小时（或过夜）

4. 解旋

将载玻片置于碱性缓冲液（300mM NaOH, 1mM EDTA, pH>13）中

室温解旋20-40分钟，使DNA双链解旋并暴露损伤位点

5. 电泳

在相同碱性缓冲液中进行电泳

条件通常为：25V，300mA，20-30分钟（具体参数需优化）

电泳槽需保持4℃以维持DNA结构

6. 中和与染色

用中和缓冲液（0.4M Tris-HCl, pH 7.5）中和2-3次，每次5分钟

用荧光染料（如EB、SYBR Green等）染色

避光保存待观察

7. 观察与分析

在荧光显微镜下观察（激发波长与所用染料匹配）

每样品至少观察50-100个细胞

使用专业软件（如CASP、CometScore等）分析彗星参数：

尾长（Tail Length）

尾矩（Tail Moment）

尾DNA百分比（% Tail DNA）

彗星实验的步骤

彗星实验虽然原理简单，但实际操作中需要精细的技术控制和丰富的经验积累。对于科研人员来说，如果时间有限或缺乏相关实验条件，选择专业的科研服务机构是一个高效可靠的选择。

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