不同的细胞机制是三阴性乳腺癌化疗和 PD-L1 阻断联合治疗的基础

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文献概述

背景：三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最难治的亚型。紫杉醇（PTX）和白蛋白结合型紫杉醇（Nab-PTX）是关键的化疗药物，Nab-PTX是PTX与白蛋白结合的修饰形式。2019年，FDA根据IMpassion130试验结果，加速批准atezolizumab（ATZ）联合Nab-PTX治疗不可切除的局部晚期或转移性 TNBC。然而，在IMpassion131试验显示与PTX联合治疗无进展生存期没有显著改善后，ATZ在TNBC中的批准被撤销。这些相互矛盾的结果引发了关于PTX和Nab-PTX对TIME的不同影响以及它们在 TNBC治疗中与ATZ的复杂相互作用的关键问题。

方法：从接受Nab-PTX或其与ATZ联合治疗的TNBC患者收集了配对的肿瘤活检样本。通过利用scRNA-seq并整合之前研究的数据，表征了TNBC中的TIME动力学，并确定了与不同治疗方式的临床结果相关的细胞成分。重要的是确定肥大细胞是与ICB联合治疗的有前途的候选者，为未来联合疗法的研究提供了新的途径。

数据：GSE169246，GSE266919

结果及结论：与ATZ加PTX相比，ATZ加Nab-PTX重新连接TCF7干细胞样效应记忆CD8T细胞（Tsem）和CD4T滤泡辅助细胞（Tfh）细胞。与PTX不同，白蛋白结合型紫杉醇还可以重塑髓系细胞，扩增肥大细胞和促炎巨噬细胞。强调了肥大细胞在协调抗肿瘤免疫反应中的关键作用，可能是通过促进T细胞和B细胞的募集和激活。体内实验表明，与PD-L1阻断一起激活肥大细胞可减轻TNBC进展，表明肥大细胞是增强ICB治疗效果的一种有前途的辅助手段。

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文献内容

1.TNBC 中的免疫细胞图谱和动力学

从44例TNBC患者那里获得了78份肿瘤活检样本。其中，16 人Nab-PTX + ATZ治疗，12 人Nab-PTX治疗，9 人接受了 PTX+ATZ治疗，7 人PTX治疗。包括原发性乳腺肿瘤和转移病灶，并分为反应者（R）和无反应者（NR）。

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利用 scRNA-seq 来分析 TNBC 和 T 细胞受体（TCR）测序（TCR-seq）中的免疫浸润，以阐明 TCR 库。经过严格的质量过滤鉴定出 447,494 个免疫细胞，其中 171,350 个来自 Nab-PTX+ATZ 组，81,921 个来自 PTX+ATZ 组，131,076 个来自 Nab-PTX 组，63,147 个来自 PTX 组。包括 285,001 个 T 细胞、87,595 个 B 细胞、18,718 个自然杀伤 （NK） 细胞和 56,180 个髓系细胞。

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T 细胞较少，而髓系细胞在胸壁中富集。B 细胞在淋巴结中更丰富，而 NK 细胞在肝脏中增加。此外，与局部晚期肿瘤相比，转移性疾病中的 T 细胞和 B 细胞水平较低，但 NK 和髓系细胞水平较高。

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PTX 后 T 细胞和 NK 细胞增加，而 Nab-PTX+ATZ 后髓系细胞减少。化疗后应答者的 T 细胞增加，而 B 细胞在接受 Nab-PTX+ATZ 治疗的应答者中呈上升趋势（虽然但是中位数低了啊），但在 PTX 后下降。相比之下，接受 Nab-PTX+ATZ 的反应者髓系细胞减少，而 NK 细胞随着 PTX 的增加而增加。

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较高的 B 细胞基线水平与对联合疗法和 PTX 的良好反应相关（相关吗？看P002患者的B细胞高到离谱了，也没有R；P017，P057也都基线B比例低），而 T 细胞是 Nab-PTX 的有利预测因子。

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看这个图，也不是很相关的样子。

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进一步细分亚群。

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B 细胞亚群表现出高预测指数，并且与对 Nab-PTX+ATZ 的良好反应相关，而 Bfoc 和 CD4 T 细胞表现出高治疗指数，表明它们的反应者增加。同样，Bfoc 有助于对 PTX+ATZ 的有效反应。确实可以看出不同治疗方式下，免疫细胞动态变化。

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使用mIHC评估 16 个肿瘤样本中的 CD8T 细胞、CD4T 细胞和 CD20B 细胞，与scRNA-seq数据一致。Nab-PTX+ATZ 后反应性肿瘤中CD20+B与 scRNA-seq 观察到的趋势一致。

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此外评估了用这种联合疗法治疗的肿瘤中的 PD-L1 水平，大多数反应者是PD-L1 阴性肿瘤。

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2.治疗后 CD8T 细胞的差异动力学

细分28个 T 细胞亚群、14 个 B 细胞亚群、11 个 NK 细胞亚群和 18 个髓系细胞亚群。

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CD8T 细胞由 12 个异质亚群组成，包括初始（Tn-CCR7）、中枢记忆（Tcm-CXCR4）、效应（Teff-GNLY）、效应记忆（Tem-CCL4 和 Tsem-EOMES）、干扰素反应（Tisg-ISG15）、应激（Tstr-HSPA1A）、耗竭（Tex-PDCD1、Tex-GZMB、Tex-ISG15）、增殖（Tex-MKI67）和粘膜相关不变 T （MAIT-KLRB1） 细胞亚群。

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确定了由 CXCL13 和 LAG3 表达标记的四个 Tex 亚群，每个亚群具有不同水平的耗竭、效应和记忆标记。

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Tex-GZMB 主要富集于 Nab-PTX 相关组。应答者，特别是对 Nab-PTX+ATZ 的反应者，表现出 Tex-GZMB 水平降低，而 NR 在治疗后表现出水平升高。相比之下，Tex-PDCD1 主要在 PTX 相关组中富集，PTX+ATZ 应答者呈增加趋势，而 PTX 应答者在治疗后呈下降。对于 Tex-ISG15 和 Tex-MKI67，均富含 Nab-PTX 相关组，治疗后反应者趋于减少。这些发现表明，与其他方案相比，Nab-PTX+ATZ 降低了 Tex 水平，而 PTX+ATZ 似乎增加了 Tex 水平。联合治疗后反应者的 Tsem 增加，尤其是在 Nab-PTX+ATZ 治疗后。

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3.CD8T细胞的过渡动力学

源自 Tn 的两个分支，其中 Tex 或 Tem 作为基于扩散图的末端状态 (在 Tex 谱系中，Tex-PDCD1 和 Tex-GZMB 位于末端并相互重合，而在 Tem 谱系中，Tsem 伴随着 Teff 和 Tex-ISG15 作为末端状态。具体来说，在对 Nab-PTX+ATZ 的反应者中，Tex 谱系在治疗前肿瘤中占主导地位，而治疗后肿瘤则显着向 Tem 谱系转变。相比之下，NR 在治疗后显示出对 Tex 谱系的富集。这些结果表明，Nab-PTX+ATZ 有效地阻止了反应者的 T 细胞耗竭，而在 NR 中，治疗对 TIME 的影响有限，反映了 T 细胞耗竭的自然进展。

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有效的 Nab-PTX+ATZ 减轻了 Tex 亚群之间的转换，同时增加了 Tsem 的转换。具体来说，在 Tex 细胞中观察到显著的转变，以及在对 Nab-PTX+ATZ 有反应的治疗前肿瘤中 Tem 和 Tn、Tcm 和 Tstr 之间观察到显著转变，而治疗后，在 Tsem、Tcm 和 Tem 之间观察到显著转变。

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Nab-PTX + ATZ 将过渡hub从 Tn 和 Tex-GZMB 转移到 Tsem 和 Tem。相比之下，在有效的 PTX+ATZ 后观察到 CD8T 细胞过渡动力学的变化最小。对于化疗，有效治疗后 Tn、Tem 和 Tsem 的过渡hub持续增加。

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总的来说，研究结果表明，Nab-PTX+ATZ 不仅可以抑制 Tex 群体的过渡活性，还可以重新连接干细胞样 Tem 细胞，从而获得增强的疗效。相比之下，PTX+ATZ 似乎实现了部分效应，导致 Tex 转换适度减少，而无新转换的 Tem 群体。两种化疗都显示出对 Tem 和 Tex 细胞的影响有限，但倾向于促进 Tn 细胞的扩增。

4.CD8T 细胞与临床反应的相关性

Pi 分析一致地显示 Tex 细胞与有利反应有关，而 Tstr 与不利反应相关。处理后，Tsem 在反应者中表现出更高的分数，而 Tex-GZMB 在 NR 中更普遍，这与 Ti 分析一致。这些观察结果进一步强调了有效的 Nab-PTX+ATZ 处理后 Tem 的扩张以及 Tex 的收缩。PTX+ATZ 反应者在治疗前和治疗后组中表现出较高的 Tex-PDCD1 分数，而 NR 表现出较高的 Tisg 和 Tstr 分数。

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5.反应性肿瘤浸润 CD4T 细胞

16 个不同的CD4T子集，包括初始（Tn-CCR7 和 Tn-IL7R）、中枢记忆（Tcm-CXCR4）、主动（Tact-FOS）、效应器（Teff-TNF）、效应器记忆（Tem-GZMK 和 Tem-CCL5）、IFN 反应相关（Tisg-ISG15）、应激（Tstr-HSPA1A）、耗竭（Tex-LAG3 和 Tex-MKI67）、滤泡辅助性 （Tfh-CXCR5、Tfh-IL6ST 和 Tfh-DUSP4） 和调节 （Treg-FOXP3 和 Treg-MKI67） 子集。

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三个 Tfh 亚群都表达经典的 Tfh 标志物，如 IL6ST、CXCR5 和 BCL6。Tex 和 Tfh 都表达高水平的 CXCL13 和 PDCD1，表明它们作为之前研究中鉴定的 CXCL13 T细胞的组成部分参与其中。

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接下来推断 CD4T 细胞的发育轨迹起源于 Tn-CCR7，分为三条路径，其中 Treg、Tex 和 Tfh 以及 Tem 分别位于末端状态。

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Tfh 和 Tex 亚群在反应者中富集并与对联合治疗的良好反应有关，而 Tstr 和 Teff 在 NR 中富集并表明不良结果。Treg 在 NR 中富集，并与对 PTX+ATZ 的不良反应相关。

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对 Nab-PTX+ATZ 的反应者表现出 Treg、Tex 和 Tisg 水平降低，同时 Tn-IL7R 和 Tfh 水平升高。相比之下，NR 显示 Tex 水平升高，同时 Tn-IL7R 降低。Nab-PTX+ATZ 在促进 Tfh 扩增的同时降低了 Treg 和 Tex。

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总的来说，这些发现表明 Tfh 的增加以及 Treg 和 Tstr 的同步降低对于有效的 TNBC 治疗至关重要。与 Nab-PTX+ATZ 相比，Treg 和 Tstr 可能会阻碍 PTX+ATZ 的疗效。

6.Tfh/Tex 的谱系动力学及其与临床反应的相关性

Tfh-DUSP4 为过渡状态，产生三个分支，其中 Tex-LAG3 、 Tfh-CXCR5 和 Tfh-IL6ST 位于不同的分支中 。

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对 Nab-PTX+ATZ 的反应者表现出 Tfh-DUSP4 和 Tex-LAG3 的治疗前富集，治疗后转变为 Tfh-CXCR5 和 Tfh-IL6ST 的富集，而 NR 显示治疗后 Tex-LAG3 的增加。表明Nab-PTX+ATZ 阻碍了 Tfh-DUSP4 向 Tex 的分化，而是使其偏向 Tfh。相比之下，有效的 PTX+ATZ 治疗显示从 Tfh-DUSP4 到 Tfh-CXCR5 的微小变化。对于化疗，有效的治疗始终将 Tex-LAG3 转向 Tfh-DUSP4。

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7.响应 Nab-PTX 相关疗法的肥大细胞扩增

Nab-PTX 后反应者肥大细胞浸润的增加趋势，无论是单独使用还是与 ATZ 组合联合使用，尽管 p 值不显著。

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然后利用小鼠 4T1 乳腺肿瘤模型来验证 Nab-PTX 和抗 PD-L1 治疗的效果。肥大细胞可能与 T 细胞募集有关，特别是增强 Tn，Tn 随后转变为 Tem 和功能失调表型，而抗 PD-L1 治疗保留了 Tsem 并防止了 T 细胞功能障碍。

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8.与 T 细胞反应相关的肥大细胞活化及其关键调节因子

使用化合物 48/80 三盐酸盐 （C48/80） 在同基因小鼠肿瘤模型中启动肥大细胞活化，这是一种促进肥大细胞脱颗粒的阳离子激动剂。用抗 PD-L1 抗体 C48/80 及其组合处理小鼠。C48/80 处理显著增加了肥大细胞、CD8 GZMB T 细胞和 CD4 CXCR5 PD-1 T细胞。

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9.Nab-PTX 加 ATZ 阻止了 cDC 转变

mDC 显示与 cDC1 和 cDC2-CLEC10A 的转录组关联，与 cDC1 的联系更强，表明 cDC1 和 cDC2 可能转变为 mDC 状态。

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在反应者中，Nab-PTX+ATZ 治疗显著降低了 cDC1 和 cDC2-CLEC10A 向 mDC 的转变电位，以及 cDC1 向 cDC2-CLEC10A 和 cDC2-CLEC10A 向 cDC2-CD1A 的转变电位，而 NR 显示这些子集之间的过渡电位增加。其他治疗没有产生如此有影响的结果或达到类似的效果。有趣的是，Nab-PTX 治疗增强了反应者从 cDC2-CLEC10A 到 mDC 和 cDC2-CD1A 的转变。表明Nab-PTX+ATZ有效地阻碍了 cDC1 和 cDC2-CLEC10A 向免疫调节 mDC 状态的转变。

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与 PTX+ATZ 相比，Nab-PTX+ATZ 导致 cDC1 和 cDC2-CLEC10A 水平升高，同时 cDC2-CD1A 水平降低，而 PTX+ATZ 诱导更高水平的 cDC2-CD1A。Nab-PTX+ATZ 的良好反应似乎与更高水平的 cDC1 和 cDC2-CLEC10A 有关，而 PTX+ATZ 可能会通过增加免疫调节 DC 亚群来损害疗效。

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10.肥大细胞在优化 Nab-PTX 加 ATZ 中的重要性

肥大细胞脱颗粒色甘酸二钠 （DSCG）

用 Nab-PTX +抗 PD-L1 抗体处理小鼠 4T1 乳腺肿瘤模型，Nab-PTX 联合抗 PD-L1 治疗可显著抑制肿瘤生长。然而，当包括 DSCG 时，肿瘤缩小受到影响，这强调了肥大细胞在增强这种联合疗法的有效性方面的关键作用。

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进一步进行了 RNA-seq 以研究小鼠 TME 动力学，DSCG 联合治疗升高了调节性或抑制性 DC 亚群，尤其是 mDC 和 cDC2-CD1A。这些结果表明肥大细胞在调节抑制性 DC 亚群中具有双重作用。此外，肥大细胞抑制降低了 Tn、Tcm、Tsem、Tfh、Bn 和 Pc，同时增加了 Tisg。总体而言，这些发现加强了肥大细胞在调节免疫群体中的关键作用，这对有效的 Nab-PTX 和抗 PD-L1 治疗至关重要。

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11.TNBC 中单核细胞/巨噬细胞的特征

两个单核细胞亚群和 12 个巨噬细胞亚群。

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MT1X 和RNASE1 有利于 M2 特征，而CCL2 和ISG15 同时表现出 M1 和 M2 特征。

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基于细胞组成构建了相关网络，并揭示了响应 Nab-PTX+ATZ 的肿瘤中的共调控模块。

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12.单核细胞/巨噬细胞对不同疗法的响应动力学

在对 Nab-PTX+ATZ 有反应的肿瘤中，观察到免疫抑制性巨噬细胞水平降低，例如macro FN1、macro MT1X 和macro RNASE1，同时治疗后促炎亚群如macro CXCL9、macro FOLR2 和单 IL1B 增加。

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Macro-FOLR2，类似于与人乳腺癌中 CD8 T 细胞浸润相关的 FOLR2 组织驻留巨噬细胞，在治疗前和治疗后的反应性肿瘤中与 Tn 和 Bn 聚集。此外，macro-FOLR2 可能通过补体系统培养其他巨噬细胞，尤其是 macro-CXCL9 和 macro-CCL3L1。

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13.肥大细胞通过骨髓细胞塑造 TNBC 的免疫景观

分析了来自小鼠 4T1 乳腺肿瘤模型的 RNA-seq 数据，发现与 Nab-PTX 和抗 PD-L1 治疗相比，用 DSCG 抑制肥大细胞减少了促炎巨噬细胞，如macro CXCL9、macro CCL3L1 和macro CCL2，同时增加了抑制性巨噬细胞，如macro MT1X、macro IL1B 和单 S100A8，表明肥大细胞可能通过增强促炎巨噬细胞参与免疫调节。

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14.肥大细胞作为增强 ICB 反应的新兴治疗靶点

接下来试图研究肥大细胞作为协同伙伴的潜力，旨在确定它们的激活是否可以放大 ICB 的疗效，尤其是 PD-L1 阻断。RNA-seq 分析显示，在 C48/80 加抗 PD-L1 治疗后，几种关键免疫细胞亚群的水平增加，包括 Tsem、Tn-IL7R、Tcm、Bfoc 和 cDC1。有益免疫细胞群的这些升高伴随着失调或抑制亚群的减少，例如 Tex 、 Treg 、 mDC、 macro-MT1X 和 mono-S100A8。总的来说，肥大细胞活化不仅增强了关键的抗肿瘤免疫细胞，而且还重塑了 TME，为有效的抗肿瘤反应创造了有利的环境。

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总结

1. 这项研究中检查了免疫细胞动力学及其与临床反应的关联。CXCL13T 细胞在对 PTX+ATZ 的良好反应中起关键作用。Nab-PTX+ATZ 将功能性 CD8T 细胞从耗竭转变为干细胞样效应记忆表型，将功能性 CD4T 细胞转变为具有干细胞样特征的 Tfh 状态。Nab-PTX+ATZ 还减少了 Treg 和抑制性巨噬细胞，同时阻止 cDC1 和 cDC2 转变为免疫调节状态。这些发现表明 Nab-PTX+ATZ 促进了强大而持续的 T 细胞反应。相比之下，PTX+ATZ 的反应者表现出 CD8 Tex 和 CD4 Tfh 增加，以及 Treg 和抑制性巨噬细胞升高，这可能解释了有限的临床疗效。
2. 开发增强肥大细胞活化或浸润的药物可以增强 TNBC 的抗肿瘤免疫力。