【QuPath】Multiplexed analysis之多重免疫荧光分析教程
【QuPath】Multiplexed analysis之多重免疫荧光分析教程
结合自己的图像数据，把官方教程“汉化”一下，加上一些容易被忽略（让我踩了很多坑）的细节，希望能帮到大家~
也尝试过FIJI，整了一大堆宏，但是我发现对于特别密集的细胞，FIJI（尤其是基于阈值和分水岭的宏）在分析「细胞密集区域」时确实存在明显的局限，尤其体现在以下几点：
🔍 FIJI 在细胞密集图像中的局限性：
问题 | 说明 |
|---|---|
🎯 「细胞分割精度差」 | 分水岭算法容易把一个密集团错误分为1个大细胞或切割错误。 |
🧠 「没有细胞语义识别能力」 | 无法区分细胞核 vs 胞质，或者多通道间的复合判断。 |
📉 「阳性细胞定量误差大」 | 当强阳性信号覆盖多个细胞时，FIJI 无法区分每个细胞强度，只能粗略统计面积或灰度值。 |
🔌 「插件或宏过于机械」 | 没有 AI 辅助，逻辑判断只依赖图像处理操作，灵活度差。 |
✅ 为什么 QuPath 更适合这种 「多通道 + 密集细胞图像分析」
优势 | 表现 |
|---|---|
✅ 「细胞级检测」 | 用 DAPI 准确定位细胞，再叠加通道判断，单细胞分析精度高。 |
✅ 「多通道阳性标记分析」 | 可以每个通道单独设阈值，然后合并双阳性、三阳性。 |
✅ 「可视化; 导出分析数据」 | 可导出每个细胞的通道强度、阳性分类、空间位置等。 |
✅ 「支持分类、脚本和批量处理」 | GUI+自动化双支持，适合样本量大的分析需求。 |
本文会尝试将QuPath分析过程尽量细化，希望为大家提供mIHC定量分析的全套流程~
官方用了一张7色的图像（The LuCa-7color image），我们先不要一来就上强度，先从最基础的三色开始
开始之前，先创建一个项目，后续的分类器会自动保存在这个项目对应的文件夹下。
第一步 设置分类（Setting up the classifications）
选择⋮ Populate from image channels
第二步 检测和测量细胞（Detect & measure cells）
一般我们是以DAPI为基准来检测细胞~
这里的参数取决于你的细胞大小和像素大小
「右键双击」可以更改这两个参数！
运行以后，能看到检测到的object数量：
第三步 为每个marker创建一个标记（Create a classifier for each marker）
创建训练图像
为每个需要分类器的通道创建重复图像（在此之前一定要运行cell detection哦）： 「Classify ‣ Training Images ‣ Create duplicate channel training images」
注意要勾选Initialize Points annotation~
这个时候在左边的窗口可以看到多了6张图片，分别对应不同的通道
训练和保存分类器
这里要注意，每一个图像中都有运行cell detection后的“红圈圈”，也就是检测到的细胞
应该是上面这样，如果还是像下面那样，就要检查上一步操作，重复看看。
如果没有问题，就开始对每个通道的图像进行「Classify ‣ Object classification ‣ Train object classifier」
❝关键步骤是，为感兴趣的分类（例如CK）标注“阳性”细胞，并为“阴性”细胞标注特殊分类Ignore*。 在训练标注中不使用其他任何分类。 ❞
分别对每个通道图像进行这一步操作，然后保存分类器
这样的话，我们就得到了每一个通道对应的分类器。
❝PS：这里很容易报错
出现这个报错的时候，要注意：必须要在识别到的区域上圈出至少两类的classification！！！相当于在已经识别到的（比如是）1081个细胞区域上人工注释几个细胞类型，不要在未被识别到的区域凭空注释！！！！ ❞
合并分类器
现在返回到原始图像中，选择「Classify ‣ Object classification ‣ Load object classifier」
更方便的一步是
保存并运用以后，大功告成，我们得到了三阳性、双阳性的细胞，导出为结果即可开始分析啦
也可以换一种表现形式
腾讯云开发者
