网页工具 | 综合计算分析确定了在癌细胞和T细胞中具有双重作用的治疗靶点

生信菜鸟团

发布于 2025-05-09 02:29:15

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Basic Information

英文标题：Integrated computational analysis identifies therapeutic targets with dual action in cancer cells and T cells
中文标题：综合计算分析确定了在癌细胞和T细胞中具有双重作用的治疗靶点
发表日期：11 March 2025
文章类型：Resource
所属期刊：Immunity
文章作者：Ce Luo | Zexian Zeng
文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S107476132500072X

Highlights

Para_01

ICRAFT是一个用于识别免疫调节靶点的交互平台
ICRAFT揭示了基因扰动与免疫表型之间的因果关系
ICRAFT确定了关键的免疫肿瘤学靶点，包括TNFAIP3、PTPN2和SOCS1
TNFAIP3的缺失增强了T细胞和癌细胞中的免疫介导的癌细胞杀伤

Summary

Para_01

许多靶向癌细胞通路的癌症药物也会损害免疫系统。
我们开发了一种计算目标发现平台，以便检查癌细胞和免疫细胞，从而识别抑制肿瘤进展并增强抗肿瘤免疫的通路。
免疫相关CRISPR筛选分析器（ICRAFT）集成了免疫相关的CRISPR筛选数据集、单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据以及临床试验的治疗前RNA测序数据，使我们能够采用系统级方法进行治疗目标发现。
使用ICRAFT，我们鉴定出许多能够增强癌细胞对免疫攻击的敏感性和T细胞激活的靶点，其中包括肿瘤坏死因子（TNF）α诱导蛋白3（TNFAIP3）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型2（PTPN2）和细胞因子信号传导抑制剂1（SOCS1）。
在癌细胞中，Tnfaip3（A20）基因缺失激活了TNF-核因子κB（NF-κB）通路，促进了趋化因子的表达和T细胞向肿瘤的招募。
由T细胞介导的Tnfaip3缺失癌细胞的清除主要通过TNF诱导的细胞凋亡驱动。
在T细胞中失活Tnfaip3增强了抗肿瘤功效。
通过整合各种功能基因组学和临床数据集，ICRAFT提供了一个交互资源，有助于更深入地理解抗肿瘤免疫和免疫肿瘤药物开发。

Graphical abstract

Keywords

tumor immunity; CRISPR screen data; A20; ubiquitin-editing enzyme; NF-κB; autoimmunity; dual-effect targets; functional genomics; cancer immunotherapy

Introduction

Para_01

免疫检查点阻断（ICB）在不同类型的癌症治疗中表现出显著的疗效。
针对不同通路的免疫治疗方法的组合具有长期的临床益处。
然而，只有部分患者能够看到临床益处，而且在最初显示出反应的个体中经常会出现抗性。
这些观察结果引导研究向两个方向发展。
第一个方向是寻找预测治疗反应的生物标志物，包括PD-L1（程序性死亡配体1）表达、微卫星不稳定性（MSI）、肿瘤突变负荷（TMB），以及从下一代测序技术中获得的基因谱，从而优化现有治疗方法的选择。
第二个方向集中在新的治疗模式上，包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法、T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）、细胞因子治疗、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法，以及探索新型免疫治疗靶点。
在这其中，免疫治疗靶点的探索起着至关重要的作用。
针对如PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）、CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4）和HER2（人类表皮生长因子受体2）等通路的靶向治疗已经彻底改变了多种癌症的治疗方法。
因此，在肿瘤免疫背景下追求新靶点是一个提高免疫治疗效果的有前景策略。

Para_02

CRISPR 筛选是一种高通量遗传方法，用于识别扰动后导致特定功能结果的基因。
该技术广泛应用于识别对肿瘤免疫逃逸和免疫反应至关重要的遗传决定因素。
例如，敲除 PBRM1、GLUT1 基因以及干扰素（IFN）-γ 受体信号通路中的组分可以使癌细胞对 T 细胞介导的细胞毒性更加敏感。
此外，通过混合体内 CRISPR 筛选揭示的基因功能丧失（LOF），包括 PTPN2、ADAR1、COP1 和 SETDB1，可以增强免疫治疗干预的效果。
CRISPR 筛选还适用于研究免疫细胞，特别是 T 细胞，包括增殖、细胞因子分泌、激活、功能障碍以及对抑制条件的抵抗力等方面。
有大量的 CRISPR 筛选数据集，提供了基因扰动与免疫相关表型之间的因果关系。
整合这些由 CRISPR 得到的数据集与其他多组学数据，为增强肿瘤免疫提供了识别稳健功能基因靶点的机会。

Para_03

肿瘤坏死因子（TNF）诱导蛋白3（TNFAIP3），一种泛素编辑酶，也被称为A20，抑制核因子κ-B（NF-κB）激活和TNF诱导的细胞凋亡。
TNFAIP3还在IFN信号传导中发挥作用，促进自噬，并抑制焦亡、坏死性凋亡、细胞凋亡或这些细胞死亡形式的组合。
TNFAIP3位点的多态性与炎症性疾病相关联。
TNFAIP3中的有害突变会导致患者早期发作的系统性炎症。
临床上，B细胞淋巴瘤中TNFAIP3的失活与疾病的发生有关。
然而，在T细胞淋巴瘤患者中，TNFAIP3突变与较高的生存率相关。
在癌细胞中，TNFAIP3似乎通过增加STC1的表达来抑制‘吃我’信号，从而参与免疫逃逸。
此外，在小鼠肺腺癌（LUAD）细胞中删除TNFAIP3会增加对PD-L1治疗的敏感性。
在黑色素瘤细胞中，TNFAIP3通过STAT3（信号转导及转录激活因子3）信号通路增强PD-L1的表达。
因此，TNFAIP3在致癌作用和疾病进展中有多种复杂的作用，这使得在复杂的肿瘤微环境中区分细胞特异性作用变得困难。

Para_04

许多旨在靶向癌细胞的癌症治疗方法无意中损害了免疫系统。
此外，大多数来自相关转录组学研究的基因靶点缺乏直接的功能效应，使得建立基因扰动与免疫相关表型之间的因果关系变得困难。
为了解决这些差距，我们开发了免疫相关CRISPR筛选分析器（ICRAFT），这是一个具有大规模经过整理的CRISPR筛选数据和转录组学数据的交互式网络平台。
ICRAFT能够系统地识别对癌细胞和免疫细胞都有双重作用的免疫调节靶标。
总计，ICRAFT汇集了来自90项研究的558个免疫相关的CRISPR筛选比较数据集，超过200万个单细胞的转录组数据，以及943个来自免疫治疗临床试验参与者的治疗前RNA测序（RNA-seq）样本。
使用ICRAFT，我们鉴定出几个基因，包括TNFAIP3、PTPN2和SOCS1，它们的缺失通过影响癌细胞和T细胞引发了有益的抗肿瘤效应。
我们的发现进一步证明PTPN2和SOCS1在癌细胞和T细胞中都发挥了双重作用。
我们发现TNFAIP3失活增强了抗肿瘤功能。
在癌细胞中TNFAIP3失活导致了强烈的T细胞介导的免疫反应，特征是CD8+ T细胞对肿瘤的浸润增加。
在T细胞中TNFAIP3失活通过激活NF-κB通路增强了细胞毒性能力。
这些发现表明，靶向TNFAIP3可以通过使耐药肿瘤更容易受到免疫介导的细胞毒性的影响，并增强T细胞的抗肿瘤能力，从而引发针对肿瘤的免疫反应。
总之，这些数据展示了ICRAFT在识别具有免疫调节效应的基因靶点方面的有效性，这将是对癌症免疫学和免疫治疗领域的一个有价值的资源。

Results

ICRAFT for immune-modulating gene identification

ICRAFT用于免疫调节基因识别

Para_01

评估一个基因靶点作为免疫治疗候选物的潜力涉及分析几个关键因素，包括基因扰动的影响、基因表达的细胞类型以及基因诱导免疫治疗反应的潜力。
为了促进这些分析，我们开发了ICRAFT，一个交互式的网络服务器，公开可用，网址为https://icraft.pku-genomics.org/，以简化具有免疫调节效果的基因靶点的识别（图1A）。
ICRAFT包含来自90项研究的558个与免疫相关的CRISPR筛选比较（表S1），来自200万细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（表S2），以及来自临床试验参与者的943个免疫治疗前处理的RNA测序样本（表S3）。
在558个与免疫相关的CRISPR筛选比较中，有397个是在癌细胞上进行的，研究了一系列表型，如主要组织相容性复合体（MHC）-I、MHC-II和PD-L1的膜表达水平，以及在与CD8+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞共培养测定中的基因扰动效应（图1B）。
161个CRISPR比较集中在免疫细胞上，包括CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。
这些筛选评估了各种表型，包括IFN-γ、IL-2和TNF的产生，以及细胞增殖、激活和吞噬作用（图1C）。
此外，在编译的数据集中，有168个比较是在体内进行的，检查了与免疫浸润和细胞毒性、细胞分化和免疫激活相关的表型（图1B和1C）。
此外，ICRAFT整合了从公共领域收集的83个scRNA-seq数据集，涵盖了31种癌症类型的200万个细胞（图1D；表S2；见STAR方法）。
为了检查临床相关性，ICRAFT包括来自18个临床试验队列的943个免疫检查点阻断治疗前样本的数据（图1E；表S3；见STAR方法）。
所有这些数据通过标准化工具和流程进行了整理、处理和质量控制（见STAR方法）。

图片说明◉ 图1。ICRAFT的特征（A）ICRAFT整合了来自90项独立研究的168个体内和390个体外免疫相关筛选比较，以及来自83个队列的200万单细胞基因表达数据集和来自18个ICB试验队列的943名患者的RNA-seq数据。（B）癌症细胞扰动筛选比较的分解。（C）免疫细胞扰动筛选比较的分解。（D）83个scRNA-seq数据集概述。（E）临床试验参与者中943名患者在免疫治疗前的RNA-seq样本概述。另请参见图S1和表S1、S2和S3。◉ 图1。ICRAFT的特征（A）ICRAFT整合了来自90项独立研究的168个体内和390个体外免疫相关筛选比较，以及来自83个队列的200万单细胞基因表达数据集和来自18个ICB试验队列的943名患者的RNA-seq数据。（B）癌症细胞扰动筛选比较的分解。（C）免疫细胞扰动筛选比较的分解。（D）83个scRNA-seq数据集概述。（E）临床试验参与者中943名患者在免疫治疗前的RNA-seq样本概述。另请参见图S1和表S1、S2和S3。◉ 图1。ICRAFT的特征（A）ICRAFT整合了来自90项独立研究的168个体内和390个体外免疫相关筛选比较，以及来自83个队列的200万单细胞基因表达数据集和来自18个ICB试验队列的943名患者的RNA-seq数据。（B）癌症细胞扰动筛选比较的分解。（C）免疫细胞扰动筛选比较的分解。（D）83个scRNA-seq数据集概述。（E）临床试验参与者中943名患者在免疫治疗前的RNA-seq样本概述。另请参见图S1和表S1、S2和S3。◉ 图1。ICRAFT的特征（A）ICRAFT整合了来自90项独立研究的168个体内和390个体外免疫相关筛选比较，以及来自83个队列的200万单细胞基因表达数据集和来自18个ICB试验队列的943名患者的RNA-seq数据。（B）癌症细胞扰动筛选比较的分解。（C）免疫细胞扰动筛选比较的分解。（D）83个scRNA-seq数据集概述。（E）临床试验参与者中943名患者在免疫治疗前的RNA-seq样本概述。另请参见图S1和表S1、S2和S3。◉ 图1。ICRAFT的特征（A）ICRAFT整合了来自90项独立研究的168个体内和390个体外免疫相关筛选比较，以及来自83个队列的200万单细胞基因表达数据集和来自18个ICB试验队列的943名患者的RNA-seq数据。（B）癌症细胞扰动筛选比较的分解。（C）免疫细胞扰动筛选比较的分解。（D）83个scRNA-seq数据集概述。（E）临床试验参与者中943名患者在免疫治疗前的RNA-seq样本概述。另请参见图S1和表S1、S2和S3。

Para_01

ICRAFT简化了识别具有免疫调节作用的基因靶点的过程（图1A）。
一个典型的例子是B2m基因，该基因的失活会损害T细胞的识别和激活。
我们的分析通过ICRAFT表明，癌细胞中B2m的丢失在各种CRISPR筛选数据集中损害了T细胞介导的细胞毒性（图S1A），从而展示了ICRAFT评估基因靶点功能免疫调节影响的能力。
ICRAFT还使用户能够评估感兴趣的基因靶点在不同细胞类型中的表达。
例如，PDCD1编码一种主要在激活的T细胞中表达的免疫抑制受体。
我们对23种细胞类型中PDCD1的表达分析显示，在CD8+ T细胞中显著存在，特别是在它们的激活亚群中（图S1B）。
在我们组装的数据集中，PDCD1的表达水平在治疗反应者中明显更高（图S1C），这与先前的研究一致，这些研究将PDCD1的表达与免疫治疗效果联系起来。

Para_02

ICRAFT使研究人员能够并置数据集或对其自己的筛选数据进行比较评估，与ICRAFT数据集相比。
举例来说，我们进行了ICRAFT内部两个数据集的比较分析，其中一个数据集关注T细胞对Treg的反应，通过共培养实现，另一个数据集关注TCR刺激，两者均以T细胞增殖作为读出指标。
除了确定TCR信号传导关键成分（LCP2、CD3D和CD247）和主要负调控因子（CBLB75和DGKA76）作为阳性对照外，我们的分析进一步阐明了RASA2作为T细胞激活的一致性显著负调控因子（图S1D），支持了关于RASA2在T细胞功能障碍中的关键作用的现有研究。
此外，ICRAFT允许对各种数据集进行比较分析。举例来说，我们进行了涉及五个CRISPR筛选数据集的比较研究，其中大多数数据集是为了探索在各种免疫抑制条件下的一级CD8+T细胞，旨在识别T细胞功能障碍的强大调控因子（图S1E）。

Ablation of SOCS1, PTPN2, or TNFAIP3 increases anti-tumor immunity

SOCS1、PTPN2或TNFAIP3的缺失增加抗肿瘤免疫

Para_01

我们利用 ICRAFT 来识别那些抑制后能够强有力地显著增强癌细胞对 T 细胞介导的细胞毒性敏感性的基因靶点。
我们使用稳健等级聚集（RRA）算法77对 ICRAFT CRISPR 筛选数据集进行了综合分析（参见STAR方法部分）。
这些分析所用的 CRISPR 筛选数据集是在癌细胞被转导了全基因组单导向 RNA（sgRNA）文库之后，并随后与活化的细胞毒性 T 细胞共同培养条件下产生的（图2A）。
总共纳入了34个全基因组筛选数据集，涵盖了11种不同癌症类型的18个细胞系，用于评估（图S1F；表S4）。
在排名前20位的基因中，发现了几个关键的 T 细胞介导的肿瘤免疫调节因子，包括 NF-κB（TRAF2、BIRC2 和 TNFAIP3）、JAK-STAT（PTPN2 和 SOCS1）以及 MHC-I 抗原呈递（TMEM127 和 SUSD6）通路中的基因，证明了关键调节因子可以被稳健地识别出来（图2B和2C；表S5）。
此外，我们研究了赋予癌细胞对细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）介导的细胞毒性抗性的基因靶点。
排名前20位的富集基因与 IFN-γ 信号传导（JAK1、STAT1、IFNGR1 和 IFNGR2）和 MHC-I 抗原呈递（B2M、TAP1 和 TAP2）通路相关（图S1G和S1H）。
值得注意的是，据报道，NF-κB、IFN 和 MHC-I 通路中基因的突变赋予了癌细胞对抗免疫治疗干预的抵抗力。

图片说明◉ 图2。整合CRISPR筛选数据集的分析揭示了在癌症和T细胞中具有双重作用的基因靶点（A）说明了识别癌症细胞中基因靶点以增强T细胞介导的细胞毒性的整合分析。（B 和 C）（B）排名图显示前20个基因，（C）对从（A）中得出的前146个基因靶点（RRA评分<0.0001）进行过度表示富集分析。（D）说明了识别T细胞中基因靶点以增强T细胞适应性的整合分析。（E 和 F）（E）标记前20个基因的排名图，（F）对从（D）中得出的前208个基因靶点（RRA评分<0.0001）进行过度表示富集分析。（G 和 H）目标发现过程的流程图（G），突出两个分析中共同的目标，分别针对癌症和T细胞。系统目标识别结果的散点图（H）。RRA评分的统计截止值在（G）中为0.0001，在（H）中为0.01。（I 和 J）过度表示富集分析（I）和PPI网络分析（J），以检查在（H）中确定的具有癌症和T细胞双重作用的82个目标。另见图S1和表S4和S5。

Para_01

我们接下来利用ICRAFT来确定那些抑制后能够显著改善T细胞功能的基因靶点。
从ICRAFT检索到了研究CD8+ T细胞的CRISPR筛选数据集，并进行了分析（图2D；参见STAR方法部分）。
这涉及整合和分析了20个专注于CD8+ T细胞的CRISPR筛选数据集。
这些数据集最初是用于评估与T细胞激活、增殖、肿瘤浸润和IFN-γ分泌相关的表型（图S1I；表S4）。
我们的综合分析识别出几个阳性对照基因，包括TCR信号通路中的关键调控因子（CBLB、CD5和TMEM222）、IFN-γ信号通路（SOCS1）和TNF-NF-κB信号通路（TNFAIP3）中的关键调控因子（图2E和2F；表S5）。
值得注意的是，与线粒体健康和氧化磷酸化（OXPHOS）调控相关（ZC3H12A和CYC1），以及二酰甘油激酶（DGKZ和DGKA）相关的基因也被列为前20名候选基因（图2E和2F；表S5）。
这一发现与最近的研究相一致，这些研究表明线粒体代谢和能量产生在线粒体抗肿瘤功能中起着至关重要的作用。
此外，我们将分析扩展到识别那些失活会导致T细胞功能障碍的基因靶点，并揭示了TCR信号通路（LCP2、VAV1、CD247和ZAP70）和tRNA代谢（AARS、FARSA）通路的显著参与（图S1J和S1K）。

Para_02

在上述分析中，我们获得了抑制后能增强癌细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感性的基因靶点和失活后能增强T细胞功能的基因靶点。
使用严格阈值（RRA评分<0.0001）进行探索性分析确定了两个分析之间的八个重叠基因靶点（图2G），突出了在肿瘤免疫微环境中的癌细胞和CD8+ T细胞中起关键作用的一组基因。
接下来，我们进行了系统分析，采用较宽松的阈值（RRA评分<0.01），将列表扩展到82个基因，其中SOCS1、PTPN2和TNFAIP3是主要的（图2H；表S5）。
最近的研究强调了细胞因子信号传导抑制物1（SOCS1）和非受体型酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）在癌症和免疫细胞中的双重作用。
SOCS1失活导致癌细胞中细胞因子诱导的凋亡增加，并且增强了CD8+ T细胞的增殖和激活。
类似地，癌细胞中PTPN2的缺失提高了它们对IFN-γ的敏感性和对ICB的反应，而其失活通过调节JAK-STAT信号通路增强CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。
最近开发了一种新型抑制剂，该抑制剂针对PTPN2-PTPN1，使癌细胞对IFN-γ更加敏感，并同时激活免疫细胞，在对ICB耐药的小鼠模型中诱导强大的抗肿瘤免疫。
对这82个双重效应基因的通路富集分析突出显示了几条通路，包括TCR信号传导和T细胞激活、Toll样受体级联反应、JAK-STAT信号通路以及脂质OXPHOS代谢（图2I）。
随后的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析表明，这些双重效应靶点主要富集在TNF-NF-κB信号通路、糖基化过程、巨自噬调节、羧酸代谢过程以及糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚生物合成（图2J）。

Inactivation of TNFAIP3 in cancer cells sensitizes them to CD8+ T cell-mediated cytotoxicity

在癌细胞中TNFAIP3的失活使它们对CD8+ T细胞介导的细胞毒性敏感

Para_01

双重效应分析确定了TNFAIP3作为关键靶点，与SOCS1和PTPN2一起。
SOCS1和PTPN2在癌症和CD8+ T细胞中的双重功能已经被广泛认识。
对癌症细胞系百科全书(CCLE)中1,208个人类癌症细胞系的RNA测序和蛋白质组学数据的分析揭示了高水平但变化的TNFAIP3表达模式(图3A和S2A)。
CCLE数据集的蛋白质组学数据的相关性分析确定了与TNFAIP3丰度相关的关键通路，包括抗原加工(TAP1、TAP2和TAPBP)，对IFN-γ的细胞反应(IFI16)，以及吞噬体(CTSL)(图S2B和S2C)。
相反，负相关蛋白与ATP依赖的染色质重塑(MBD3和BRD7)和多梳抑制复合物(PCGF2)有关(图S2B和S2C)。

图片说明◉ 图3。TNFAIP3在癌细胞中的缺失增强了它们对CD8+ T细胞介导的细胞毒性敏感性。(A) CCLE中1,208种癌细胞系中的TNFAIP3 mRNA水平。(B) 使用DepMap门户的1,095种细胞系的CRISPR筛选数据评估TNFAIP3、PTPN2、SOCS1和阴性对照GAPDH的基因必要性。负分表示高必要性，红线表示中位分数。(C) 插图显示体外竞争测定法用于与抗原特异性CD8+ T细胞共同培养sgCtrl和sgTNFAIP3癌细胞。左图显示sgCtrl和sgTnfaip3小鼠癌细胞混合物被OVA肽（257-264 aa，SIINFEKL）脉冲处理后，然后与预激活的OT-I T细胞共同培养。右图显示NY-ESO-1+ sgCtrl和sgTNFAIP3人癌细胞混合物暴露于转导了NY-ESO-1特异性TCR的激活的人CD8+ T细胞。(D和E) 使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)或CellTrace紫(CVT)-标记的sgCtrl小鼠(D)和人(E)癌细胞作为对照，CD8+ T细胞共培养后sgTNFAIP3细胞百分比的对数倍变化。(每组n = 3)。(F) sgCtrl和sgTNFAIP3 A549癌细胞之间差异表达基因的RNA测序分析(每组n = 3)。(G) sgTNFAIP3和sgCtrl A549癌细胞之间差异表达基因的火山图。统计显著性(-log10假发现率[FDR])相对于基因表达水平的变化(以sgTNFAIP3/sgCtrl细胞计算的对数值)进行绘制。截止值为FDR ≤ 0.05和|log2倍变化| > 0.5。(H) sgTNFAIP3与sgCtrl A549癌细胞中上调或下调通路的GSEA。(NES，标准化富集评分)。(I) 基于sgTNFAIP3细胞中差异表达基因的LISA转录因子推断，使用CistromeDB中的ChIP-seq数据。(J) 流式细胞术分析TNF(10 ng/mL)处理24小时后的sgTnfaip3和sgCtrl LLC细胞的annexin V/7AAD染色，量化annexin V阳性细胞。(K) 在E:T比例为1:5的情况下，sgCtrl与sgTnfaip3 LLC细胞与OT-I T细胞共培养时Tnfrsf1a剔除与野生型背景下的log2倍变化比率的总结。(L-O) sgCtrl和sgTnfaip3 LLC(L)和MC38(N)肿瘤在野生型C57BL/6小鼠中的肿瘤生长曲线。(每组n = 6)。流式细胞术分析sgCtrl和sgTnfaip3 LLC(M)和MC38(O)肿瘤中的免疫细胞浸润。(P) sgTnfaip3或sgCtrl LLC肿瘤对抗PD-1(200 μg/mice)或同型抗体的肿瘤生长反应(n = 6)。治疗从肿瘤接种后第9天开始，每隔3天给药一次，共给药三次。数据表示为平均值±标准差(J, K, M和O)和平均值±标准误(D, E, L, N和P)。∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, 和∗∗∗∗p < 0.0001通过双向方差分析(J-L, N和P)，单因素方差分析(D和E)，以及未配对的学生t检验(M和O)。ns，不显著。数据代表至少两次独立实验的结果(D, E, J, K和L-P)。参见图S2和表S6。

Para_01

进一步分析癌症依赖图谱（DepMap）项目中的1,095个人类癌细胞系表明，在体外增殖和存活方面，癌细胞的TNFAIP3、SOCS1和PTPN2失活没有受到影响（图3B）。
我们接下来调查了TNFAIP3缺陷是否使癌细胞对CTL介导的杀伤更加敏感。
我们通过CRISPR介导的突变生成了TNFAIP3缺失的小鼠和人类癌细胞系，并通过共培养编辑后的癌细胞与细胞毒性T细胞来进行体外竞争测定（图3C）。
基因敲除效率通过western blot分析得到确认（图S2D）。
值得注意的是，Tnfaip3失活使LLC、B16F10和MC38小鼠细胞系对T细胞介导的杀伤更加敏感（图3D和S2E）。
在携带NY-ESO-1抗原的人类癌细胞系（SW620、SW480和A549）中也观察到了类似的结果，并且这些细胞与NY-ESO-1抗原特异性初始CD8+ T细胞共同培养（图3E和S2F）。

Para_02

RNA测序分析显示TNFAIP3缺失和对照编辑的A549癌细胞之间存在显著的转录组改变（图3F）。
值得注意的是，与对照编辑的癌细胞相比，TNFAIP3缺失的细胞显示出NF-κB通路基因（NFKBIA和NFKB2）、趋化因子（CCL5和CCL20）以及免疫信号分子（IFNGR1和ICAM1）表达增强（图3F和3G；表S6）。
基因集富集分析（GSEA）进一步突显了TNFAIP3缺失细胞中多种免疫相关通路的转录激活，包括TNF信号、II型干扰素信号、细胞因子和炎症反应以及IL-17信号（图3H）。
此外，TNFAIP3缺失后，与细胞间相互作用、基质金属蛋白酶和细胞粘附相关的通路也被激活（图3H）。
为了推断介导这些观察到的TNFAIP3缺失引起的差异基因表达的转录因子（TFs），我们应用了LISA通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据和DNA结合基序来识别调控转录因子。
LISA分析暗示RELA、HES2、NR3C1、CEBPB、STAT、FOX和AP-1家族的转录因子作为潜在调节因子（图3I）。
先前的研究表明，RELA、AP-1和CEBPB在介导对TNF刺激的免疫信号分子表达方面起重要作用。
基序富集分析进一步强化了FOX和AP-1家族的作用（图S2G和S2H）。
这些发现共同表明，TNF诱导的NF-κB通路激活在癌症细胞中TNFAIP3失活后的免疫反应中起协调作用。

Para_03

在RNA测序分析中，TNFAIP3基因敲除后TNF诱导的NF-κB信号通路被激活（图3F-3H），表明TNFAIP3基因敲除后增强的CTL介导的细胞毒性是由TNF介导的。
这一假设通过用TNF处理LLC细胞进行了测试，并以IFN-γ作为比较对照。
值得注意的是，用TNF处理后TNFAIP3缺失的细胞被耗尽（图3J和S2I）。
进一步通过使用抗RIPK1抗体进行共免疫沉淀（coIP）分析TNF处理后的LLC细胞中凋亡信号复合物的招募情况，结果显示TNFAIP3缺失细胞中的凋亡复合物中caspase-8和FADD的含量增加（图S2J）。
对IFN-γ处理组的分析显示，TNFAIP3缺失癌细胞和对照编辑的癌细胞之间STAT1在酪氨酸701位点上的磷酸化没有差异（图S2K）。
为了进一步验证TNF对于使TNFAIP3缺失的癌细胞对CTL介导的细胞毒性敏感是必需的，将TNFAIP3缺失引入到TNF受体缺失（Tnfrsf1a-null）的LLC细胞中。
与CD8+ T细胞共培养实验显示，TNF受体的缺失消除了在TNFAIP3缺失的癌细胞中观察到的增强的对细胞毒性的敏感性（图3K），从而证实了在TNFAIP3缺失后观察到的增强的CTL介导的细胞毒性主要是由TNF诱导的凋亡引起的。

Para_04

为了研究Tnfaip3在免疫选择压力下调节肿瘤生长的作用，我们在野生型（WT）B6小鼠体内接种了Tnfaip3缺失细胞和对照编辑的LLC细胞（图S2L）。
与对照编辑的细胞相比，源自Tnfaip3缺失细胞的肿瘤表现出生长速率降低（图3L）。
对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的检查显示，Tnfaip3缺失肿瘤中的免疫细胞浸润显著增加，包括总CD45+免疫细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞水平更高（图3M）。
该实验使用MC38结肠癌模型进行了重复，在该模型中，Tnfaip3失活同样导致肿瘤进展延迟和肿瘤微环境（TME）中TILs增加（图3N和3O）。
综合这些数据表明，Tnfaip3的消除促进了体内增强的免疫监视。
进一步评估了Tnfaip3缺失对肿瘤对ICB治疗反应的影响。
具体而言，将对照编辑或Tnfaip3缺失的LLC细胞移植到野生型B6小鼠体内，然后用同种型对照或抗PD-1抗体进行治疗（图S2M）。
值得注意的是，仅Tnfaip3的消除就抑制了肿瘤生长，其程度类似于Tnfaip3野生型肿瘤中的ICB治疗（图3P）。
此外，与对照编辑的肿瘤相比，Tnfaip3缺失肿瘤对抗PD-1疗法的反应更为有利（图3P）。

Ablation of TNIP1 in theTNFAIP3-TNIP1 complex facilitates T cell-mediated immunosurveillance

TNIP1在TNFAIP3-TNIP1复合体中的消融促进了T细胞介导的免疫监视

Para_01

在综合分析中，TNFAIP3 相互作用蛋白 1 (TNIP1) 被确定为具有双重角色的重要靶点，既涉及癌症又涉及 T 细胞（图 2H 和 2J）。
TNIP1 通过多泛素链与免疫细胞和癌细胞中的 TNFAIP3 相互作用。
值得注意的是，对癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集的分析显示，TNIP1 在各种癌症类型中的表达模式与 TNFAIP3 非常相似（图 4A）。
此外，在 1,208 个人类癌细胞系的癌症细胞系百科全书 (CCLE) 中观察到 TNIP1 和 TNFAIP3 表达之间存在显著的相关性（图 4B）。
对九个单细胞 RNA 测序数据集的 117,256 个癌细胞的分析进一步揭示了 TNIP1 和 TNFAIP3 表达比率之间存在显著的正相关（图 4C）。
来自两种不同癌症类型的时空转录组学数据显示，TNIP1 和 TNFAIP3 的表达在特定的空间区域共定位（图 4D），并且在不同的空间细胞簇中表现出显著的正相关（图 4E）。

图片说明◉ 图4 靶向癌细胞中的TNFAIP3-TNIP1复合体增强抗肿瘤免疫（A）比较所有TCGA癌症类型中肿瘤组织与相邻正常组织之间的TNFAIP3和TNIP1表达，显示TNFAIP3和TNIP1水平的分布模式相似。◉ （B）CCLE数据集中TNFAIP3和TNIP1表达水平的相关性。◉ （C）跨9个ICRAFT scRNA-seq数据集的癌细胞中TNFAIP3和TNIP1表达百分比的相关性。◉ （D）通过Visium空间转录组测序分析的人类乳腺癌和结直肠癌样本组织切片中TNFAIP3和TNIP1表达的空间特征图。◉ （E）不同细胞簇之间TNFAIP3和TNIP1转录组表达的空间相关性。◉ （F）共聚焦显微镜图像显示LLC细胞内Tnfaip3与Tnip1的细胞内共定位。比例尺代表10 μm。◉ （G）LLC细胞内Tnfaip3与Tnip1共定位的定量。◉ （H）LLC细胞中Tnip1共免疫沉淀后未经处理或用TNF（10 ng/mL）处理1小时后的western blot分析。◉ （I）体外sgCtrl和sgTNIP1癌细胞与原代CD8+ T细胞竞争测定。NY-ESO-1+人癌细胞混合物暴露于针对NY-ESO-1抗原特异性TCR的激活CD8+ T细胞。◉ （J）确认不同人细胞系中TNIP1基因敲除效率的western blot分析。◉ （K）log2倍变化百分比，显示与针对NY-ESO-1抗原的CD8+ T细胞共同培养后TNIP1-null细胞的比例变化。数据表示为平均值±SEM（K）。∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001（A）Wilcoxon检验和（K）单因素方差分析。ns，不显著。在（B）、（C）和（E）中的统计测试是线性回归分析。数据代表至少两次独立实验（K）。

Para_01

共聚焦显微镜检测证实了Tnip1和Tnfaip3之间的细胞内共定位（图4F和4G）。此外，共免疫沉淀实验确认了它们的相互作用，并且这种相互作用在TNF处理后增强（图4H）。构建了多个表达NY-ESO-1的人类癌细胞系（PANC1、SW620和SNU398）且TNIP1缺失。随后，这些细胞系进行了竞争性测定，涉及与NY-ESO-1抗原特异性初级CD8+ T细胞共同培养（图4I）。不同细胞系中TNIP1敲除效率通过western blot分析得到确认（图4J）。将TNIP1缺失的癌细胞与NY-ESO-1抗原特异性T细胞共同培养显示，TNIP1失活使癌细胞对T细胞介导的细胞毒性更加敏感（图4K），这与TNFAIP3缺失观察到的结果相似（图3E）。因此，破坏TNFAIP3-TNIP1复合物降低了癌细胞的免疫逃逸能力。

Ablation of Tnfaip3 in T cells enhances T cell cytotoxicity

Tnfaip3在T细胞中的消融增强了T细胞的细胞毒性

Para_01

我们的分析突显了TNFAIP3在癌症和T细胞中的双重功能（图2G和2H），促使我们详细探讨其在T细胞中的抗肿瘤功能。
来自人类蛋白质图谱的数据94表明，TNFAIP3的表达在激活的T细胞中高于在初始T细胞中（图S3A）。
这一观察结果通过检查人类泛癌CD8+肿瘤浸润淋巴细胞95进一步得到确认（图S3B和S3C），其中在衰竭和效应T细胞中的TNFAIP3表达水平高于初始T细胞（图5A和5B）。
我们还研究了与TNFAIP3表达相关的基因程序在不同T细胞亚群中的情况。
在初始T细胞中，TNFAIP3与参与TCR信号通路的基因呈正相关（MALT1、NR4A2和NR4A3）（图S3D和S3E）。
在效应T细胞中，TNFAIP3的表达显示出与细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中的基因呈正相关（CXCR4、CXCR3和TNFRSF9），以及与整合素介导的信号通路中的基因呈负相关（ITGB2和PLEK）（图S3F和S3G）。
有趣的是，衰竭的T细胞显示在与细胞应激反应相关的通路中呈正富集，包括细胞衰老（ZFP36和ZFP36L2）和自噬（ATG2A），同时在核苷酸代谢中呈负富集（AK5和UPP1）（图S3H和S3I）。

图片说明◉ 图5. 在CD8+ T细胞中TNFAIP3缺失增强T细胞激活和抗肿瘤反应 (A) 肿瘤浸润的CD8+ T细胞的主要簇群以及TNFAIP3表达的均匀流形近似和投影(UMAP)可视化。Tex，耗竭性T细胞；Teff，效应性T细胞；Tnaive，初始T细胞。◉ (B) TNFAIP3在主要CD8+ T细胞簇群中的小提琴图。◉ (C) sgCtrl和sgTnfaip3编辑的活化OT-I CD8+ T细胞与MC38或LLC细胞进行体外共培养测定设置。◉ (D) 显示OT-I CD8+ T细胞中TNFAIP3缺失水平的蛋白质印迹图。◉ (E) 与sgTnfaip3或sgCtrl OT-I CD8+ T细胞共培养后MC38癌细胞存活数量。(F) 与sgTnfaip3或sgCtrl OT-I CD8+ T细胞共培养后LLC癌细胞存活数量。（每组n=3）。◉ (G) 经OVA肽（257–264 aa，SIINFEKL）刺激4小时后CD8+ T细胞中效应标记物IFN-γ的流式细胞术定量。左侧为代表性流式细胞术数据，右侧为IFN-γ+ OT-I细胞比例的汇总条形图。◉ (H) RNA测序分析显示sgCtrl和sgTnfaip3 OT-I CD8+ T细胞在与OVA肽（257–264 aa，SIINFEKL）脉冲处理的LLC癌细胞共培养4小时后的差异表达基因（每组n=3）。◉ (I) sgTnfaip3与sgCtrl OT-I细胞之间差异表达基因的火山图。统计显著性（-log10 FDR）绘制在基因表达对数变化基础上。◉ (J) GSEA显示sgTnfaip3与sgCtrl OT-I细胞之间的上调和下调通路。（NES，标准化富集分数）。◉ (K) 体内过继性T细胞转移实验设计概述。LLC-OVA癌细胞（1×10^6）皮下植入，编辑后的OT-I CD8+ T细胞（3×10^6）通过尾静脉注射在接种后第9天转移。◉ (L) 过继转移sgTnfaip3-1、sgTnfaip3-2或sgCtrl OT-I CD8+ T细胞后的肿瘤生长曲线。（每组n=6）。◉ (M) 过继转移sgCtrl或sgTnfaip3 OT-I CD8+ T细胞后LLC肿瘤内浸润的总免疫细胞（CD45+）的流式细胞术分析。◉ (N) 过继转移sgCtrl或sgTnfaip3 OT-I CD8+ T细胞后LLC肿瘤内浸润的CD8+ T细胞的流式细胞术分析。（E–G和L–N的数据表示为平均值±标准差）。◉ ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, 和∗∗∗∗p < 0.0001由Wilcoxon检验（B），双尾t检验（E、F、M和N）以及双向方差分析（G和L）确定。数据代表至少两个独立实验的结果（E–G和L–N）。另见图S3和表S6。

Para_01

为了研究 TNFAIP3 在调节 CD8+ T 细胞抗肿瘤功效中的作用，我们使用逆转录病毒基因编辑技术制备了 Tnfaip3 缺失和对照编辑的 OT-I T 细胞（见 STAR 方法）。
然后，将这些经过工程改造的 OT-I T 细胞与用卵清蛋白 (OVA) 肽（257–264 aa，SIINFEKL）处理过的 MC38 或 LLC 肿瘤细胞共培养 24 小时，以评估它们的细胞毒性（图 5C）。
基因敲除效率通过编辑后 7 天的 western blot 实验得到确认（图 5D）。
细胞毒性分析表明，与对照编辑的 T 细胞相比，Tnfaip3 缺失的 T 细胞对 MC38 和 LLC 肿瘤细胞表现出更高的细胞毒性（图 5E 和 5F）。
此外，在用 OVA 肽（257–264 aa，SIINFEKL）刺激后，与对照编辑的 T 细胞相比，Tnfaip3 缺失的 T 细胞显示出 IFN-γ 表达水平显著增加，IFN-γ 是一个重要的细胞毒性标志物（图 5G）。

Para_02

为了描述 Tnfaip3 基因敲除对 CD8+ T 细胞的影响，我们在未处理的 OT-I T 细胞以及经过 Tnfaip3 敲除或基因间靶向对照敲除的细胞上进行了 RNA 测序，这些细胞在与 LLC 癌细胞共培养后进行分析。
值得注意的是，被癌症细胞刺激的对照编辑的 T 细胞在抗原暴露后表现出预期的 Tnfaip3 表达增加（图 S3J）。
差异表达分析揭示，在 Tnfaip3 缺失的 OT-I T 细胞中，与 NF-κB 通路相关的基因（Nfkb1 和 Nfkb2）、共刺激分子（Tnfrsf4 和 Tnfrsf14）、记忆程序（Batf3）和参与 JAK-STAT 信号传导途径的效应分子（Ifng）显著上调，相对于对照编辑的 OT-I T 细胞（图 5H–5J；表 S6）。
此外，TNF 信号基因（Vcam1 和 Tnfrsf1a）、趋化因子和趋化因子受体（Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccr4、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10 和 Cx3cl1）、免疫信号分子（Ltbr、Cd24a、Cd9 和 Cd6）以及多个关键转录因子（Irf1 和 Stat5a）也有所上调（图 5H–5J；表 S6）。
令人惊讶的是，作为 TCR 信号传导负调节器的基因（Cbl 和 Cblb）以及调节 T 细胞效应分化（Fli1 和 Cd69）的基因下调（图 5H–5J；表 S6）。
利用 LISA84 推断潜在的转录因子来解释 OT-I T 细胞中 Tnfaip3 敲除后观察到的差异基因表达，我们确定了 STAT5A、JUN 和 PRC2 成分（EZH2、EZH1、EED 和 SUZ12）作为潜在的调控因子（图 S3K）。
基序富集分析进一步突出了 JUNB、NFKB2 和 BCL6 作为潜在的调控因子（图 S3L 和 S3M）。
PRC2 复合物在介导染色质抑制、指导效应 CD8+ T 细胞终末分化方面发挥作用。
总体而言，这些发现表明 Tnfaip3 失活增强了 CD8+ T 细胞中的效应编程。

Para_03

体内研究通过过继性T细胞转移评估了Tnfaip3缺失对抗肿瘤功效的影响。
将表达OVA的LLC细胞皮下移植到野生型小鼠体内，随后给予编辑后的OT-I T细胞（图5K；参见STAR方法部分）。
输注T细胞后，未观察到显著的自身免疫相关症状，如体重减轻、烦躁或食欲减退。
与接受对照编辑T细胞的小鼠相比，给予Tnfaip3缺失T细胞的小鼠肿瘤生长显著减缓（图5L）。
流式细胞术分析显示，在接受Tnfaip3缺失OT-I T细胞的小鼠中，浸润到肿瘤中的免疫细胞数量增加，包括总体CD45+白细胞和CD8+T细胞群体均有所增加（图5M和5N）。
综上所述，这些结果阐明了在CD8+T细胞中删除Tnfaip3不仅增强了它们的肿瘤杀伤能力，还促进了TILs的维持。

Combined Tnfaip3 deletion in both cancer cells and T cells enhances anti-tumor efficacy through dual effects

在癌细胞和T细胞中同时删除Tnfaip3基因能通过双重效应增强抗肿瘤功效。

Para_01

鉴于单独切除癌细胞和T细胞中的Tnfaip3观察到的抗肿瘤益处，我们接下来研究了同时在这两种细胞类型中删除Tnfaip3可能产生的潜在协同作用。
通过将Tnfaip3切除或对照切除的癌细胞与Tnfaip3编辑或对照编辑的T细胞共同培养，我们发现双重Tnfaip3失活增加了癌细胞对T细胞介导的细胞毒性的作用（图6A和6B）。
TNFAIP3-null A549癌细胞和Tnfaip3-null OT-I T细胞之间的比较基因表达分析揭示了协同通路的上调，包括NF-κB信号传导（NFKB2）、II型干扰素信号传导（ISG15和NOS2）以及TNF信号传导（NFKBIA和CX3CL1）（图S4A和S4B），表明抗肿瘤免疫增强。
这种分析还发现了不同的通路调控，其中肝细胞生长因子受体（MET）信号传导（COL1A1和FN1）在T细胞中优先上调但在癌细胞中被抑制（图S4A和S4C）。
相反，染色体组织通路（APC和NBN）和IFNGR1在癌细胞中上调但在T细胞中下调（图S4A和S4D）。
为了探索体内Tnfaip3缺失的双重效应，将Tnfaip3-null或对照编辑的LLC-OVA细胞皮下注射到WT小鼠体内，随后进行Tnfaip3编辑或对照编辑的OT-I T细胞的过继转移（图S4E）。
值得注意的是，无论是在癌细胞还是T细胞中独立删除Tnfaip3都导致肿瘤生长减少，而同时在两种细胞类型中失活则引发了最强的抗肿瘤反应（图6C和6D）。
这一表型得到了流式细胞术分析的支持，该分析显示，在给予Tnfaip3-null T细胞后，携带Tnfaip3-null肿瘤的小鼠中GZMB+ CD8+ T细胞的浸润增加（图6E）。
总体而言，这些数据强调了Tnfaip3作为放大抗肿瘤免疫的双重效应靶点。

图片说明◉ 图6。通过双重效应，TNFAIP3在癌细胞和T细胞中的耗竭增强了抗肿瘤免疫反应（A）体外共培养测定设置，将sgCtrl或sgTnfaip3原代OT-I T细胞与预孵育了OVA肽（257-264氨基酸，SIINFEKL）的sgCtrl或sgTnfaip3 MC38细胞共同培养3小时。24小时后使用流式细胞术计数存活的癌细胞数量。（B）sgCtrl或sgTnfaip3编辑后的癌细胞在与sgTnfaip3或sgCtrl编辑后的原代OT-I CD8+ T细胞共培养后的存活数量。每组n=3。（C和D）sgTnfaip3肿瘤和sgTnfaip3原代CD8+ T细胞单独或联合给予sgCtrl作为对照，在野生型C57BL/6小鼠中的肿瘤生长曲线。将sgCtrl或sgTnfaip3 LLC细胞（1×10^6个细胞）皮下注射到8周龄的C57BL/6小鼠体内。编辑后的CD8+ T细胞（3×10^6个）在癌症细胞接种后第9天通过尾静脉注射给药。（每组n=5只小鼠）。（E）流式细胞术分析肿瘤浸润的CD8+ T细胞（左侧）和GZMB+ CD8+ T细胞（右侧），CD45+细胞门控。（F）TCGA癌症类型中TNFAIP3缺失特征水平与分子表型或通路评分之间部分Spearman相关性的热图。（G）TCGA癌症类型中TNFAIP3缺失特征水平与推断的CD8+ T细胞浸润水平之间的部分Spearman相关性热图。（H）三个临床试验队列中治疗前免疫检查点阻断（ICB）治疗的响应者和非响应者之间的TNFAIP3缺失特征水平比较。（I）回归系数和p值的热图。回归系数和p值来自多元逻辑回归模型，评估TNFAIP3缺失特征与免疫治疗反应之间的关联，并将CD8+ T细胞浸润水平作为混杂变量。使用虚拟变量调整队列特异性效应。（J）根据TNFAIP3基因型进行的精心策划的癌症队列的生存分析。使用Kaplan-Meier估计计算log-rank p值以确定统计显著性。（K）森林图显示从Cox比例风险分析得出的癌症预后风险因素的风险比。完整结果见表S9。ns表示不显著，p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，通过双向方差分析（B-D）、双样本t检验（E）、Wilcoxon检验（H）、多元逻辑回归（I）和Cox比例风险分析（K）。数据以平均值±标准差表示，并代表至少两个独立实验（B-E）。参见图S4和表S7、S8、S9。

Para_01

接下来，我们探讨了TNFAIP3表达在人类癌症中的临床相关性。
基于TNFAIP3敲除后差异表达基因生成了TNFAIP3-null签名（表S7；见STAR方法）。
对CCLE数据集的RNA-seq数据分析表明，TNFAIP3-null签名与几个关键通路之间存在关联，包括p53通路、抗原加工和呈递以及细胞因子-细胞因子受体相互作用（图S4F）。
然后使用TCGA数据集对该签名进行了评估。
在大多数人类癌症类型中，TNFAIP3-null签名表现出与炎症反应、细胞因子、抗原加工和呈递以及对TNF、IFN-γ和IFN-α的反应之间的正相关（图6F）。
相反，该签名显示与免疫抑制指标，包括癌相关成纤维细胞（CAF）和M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）之间的负相关（图6F）。
进一步使用TCGA数据的相关性分析揭示了TNFAIP3-null签名与CACFD1、BRF1和WFS1等基因之间的负相关（图S4G）。
在蛋白质水平上，观察到与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）、PD-L1和脾酪氨酸激酶（SYK）之间的正相关，而与E-钙黏蛋白（CDH1）、雄激素受体（AR）、HER2和AKT之间的负相关（图S4H）。
进一步检查了TNFAIP3-null签名与TCGA批量肿瘤中CD8+ T细胞浸润之间的相关性，结果显示在各种癌症类型中与CD8+ T细胞浸润之间存在稳健的正相关（图6G；见STAR方法）。
我们在ICRAFT多个队列中的分析表明，TNFAIP3-null签名的存在与对ICB疗法的改善响应相关（图6H）。
为了考虑CD8+ T细胞浸润的潜在混杂效应，我们进行了多变量逻辑回归分析，将CD8+ T细胞浸润水平作为混杂变量（见STAR方法）。
这些分析确认，在调整了CD8+ T细胞浸润后，TNFAIP3-null签名与免疫治疗响应之间的关联仍然显著（图6I；见STAR方法）

Para_02

我们使用癌症突变数据评估了TNFAIP3改变的临床意义。
对来自TCGA数据集的24种癌症类型的分析揭示了五种类型的TNFAIP3改变，每种发生频率均低于5%（图S4I）。
大多数这些突变是错义突变，位于如磷酸化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰位点（图S4J）。
进一步分析cBioPortal癌症基因组学数据集，在该数据集中我们整理了来自97个队列涵盖31,127名患者的TNFAIP3改变概况（表S8），结果显示与野生型TNFAIP3相比，TNFAIP3改变的患者预后有所改善（图6J）。
使用COSMIC-3D数据库的研究揭示了TNFAIP3脱泛素化结构域中的第127位苯丙氨酸是一个突变热点（图S4K），这对应于单核苷酸多态性rs2230926，已与各种自身免疫性疾病相关联。
基于这一观察结果，我们将分析扩展到包括先前研究中报道的与自身免疫疾病相关的更广泛的基因，假设自身免疫相关基因的改变可能广泛关联癌症预后的改变（表S8；参见STAR方法）。
在我们的整理数据集中，观察到了其中20个基因的改变（表S8）。
使用Cox比例风险回归模型进行生存分析，调整了年龄、性别、种族和癌症类型等关键预后因素，结果显示这些自身免疫疾病相关基因的改变与较低的风险比（HR < 1，p = 0.015）相关（图6K；表S9；参见STAR方法）。
这表明这些改变与癌症患者的预后改善有关。

Para_03

除了目标优先级排序外，ICRAFT 还通过评估候选药物在不同细胞环境中的效果来促进治疗候选药物的降优先级处理。
作为一个使用案例，我们识别了基因靶点，其删除可以提高癌细胞对免疫介导杀伤的敏感性，但会对免疫细胞产生不利影响。
例如，关键的 NF-κB 信号通路成分 RELA 和 RNF31 的缺失增强了癌细胞对 T 细胞介导杀伤的敏感性（图 2B 和 S5A）。
然而，它们的失活也损害了免疫细胞的生存能力。
具体来说，由于抗凋亡基因如 Bcl-xL、c-IAP1 和 c-IAP2 表达减少，RELA 缺失细胞经历了细胞凋亡（图 S5B-S5E）。
同样地，尽管 RNF31 消融增加了癌细胞对 CD8+ T 和 NK 细胞介导杀伤的易感性，但它也在体外和体内对免疫细胞功能产生了不利影响（图 S5F-S5J）。
这些结果强调了 RELA 和 RNF31 在维持免疫细胞中的关键作用，并突显了它们不适合作为治疗靶点。

Discussion

Para_01

在这里，我们介绍了ICRAFT（https://icraft.pku-genomics.org/），一个综合性的网络平台，旨在简化具有免疫调节作用的基因靶点的优先排序。
ICRAFT利用与免疫相关的CRISPR筛选数据集来描绘基因扰动与肿瘤-免疫表型之间的联系，并进一步结合单细胞和ICB临床试验中的转录组分析，以阐明基因表达程序及其临床意义。
通过使用ICRAFT，我们识别出多种具有免疫调节作用的基因候选物，其中TNFAIP3被突出为首要目标。
实验验证证实了TNFAIP3在癌细胞和T细胞中的双重功能，这两种功能均导致增强的抗肿瘤免疫力。
除了目标优先排序外，ICRAFT还可以通过评估不同细胞类型中目标删除的效果来帮助降级基因靶点。
例如，一种在癌细胞中增加肿瘤杀伤但在T细胞中引起功能障碍的目标可能不适合治疗。
此外，ICRAFT还能够更深入地探索不太理解的生物过程，如在B细胞或巨噬细胞中具有双重作用的基因靶点。
因此，ICRAFT提供了系统识别肿瘤免疫治疗靶点的资源。
这一资源将随着新的免疫相关CRISPR筛选数据集、scRNA-seq数据以及临床试验的治疗前RNA-seq数据而继续进行维护、管理和更新。

Para_02

利用ICRAFT，我们进行了综合分析，以确定癌症和T细胞中的关键调控基因靶点。
这些分析突出了SOCS1、PTPN2和TNFAIP3作为跨两种细胞类型的显著靶点。
SOCS1和PTPN2在调节癌症和T细胞方面具有双重功能是众所周知的。
通过实验和计算分析，我们证实了TNFAIP3的双重作用。
值得注意的是，识别出的一部分基因在癌症和T细胞中具有双重作用，它们参与负向调控炎症和细胞因子信号传导通路。
理论上，这些通路内基因的缺失可能会使负向调控机制失活，从而增强与炎症相关的通路。
临床上，针对那些具有双重效应的基因进行靶向治疗可以通过增强癌细胞对免疫介导的细胞毒性敏感性同时增加免疫激活来协同增强治疗效果。
本研究代表了一次全面的分析，旨在系统地探索具有双重功能的基因靶点，跨越两种不同的细胞类型，从而为未来研究跨越多种细胞类型和表型的多面性基因建立了一个范式。

Para_03

TNFAIP3作为NF-κB活性的负调节因子和TNF介导的细胞死亡的功能。
NF-κB途径调控抗凋亡基因和生存基因以及炎症途径的表达。
Tnfaip3缺失的小鼠胚胎纤维母细胞对TNF诱导的细胞凋亡高度敏感，存活蛋白Bcl-2、c-IAP1和TRAF2的水平与Tnfaip3野生型细胞相当。
这表明TNFAIP3在不依赖于存活蛋白合成的情况下保护细胞免受凋亡。
此外，TNFAIP3缺陷触发了RIPK1激酶依赖性和非依赖性的细胞凋亡。
TNFAIP3被招募到肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）信号复合物（复合物I），在那里它稳定线性（M1）泛素网络，防止TNF受体相关死亡结构域（TRADD）或RIPK1从复合物I解离。
一旦解离，TRADD和RIPK1与FADD和caspase-8相互作用形成细胞质凋亡复合物，我们的数据证实了这一点。
TNFAIP3还通过去泛素化caspase-8来保护细胞免受凋亡，并通过去泛素化RIPK3来保护细胞免受坏死性凋亡。
我们发现TNFAIP3缺失的细胞产生高水平的炎性因子和趋化因子，如CCL2、CCL20和CXCL2，导致更多的T细胞和单核细胞募集到肿瘤微环境中。
TNFAIP3缺失的T细胞中过度的NF-κB激活增强了炎性因子的产生，而TNFAIP3缺失的癌细胞也对TNF介导的杀伤更加敏感。
这进一步促进了体内肿瘤控制的改善。

Para_04

一种针对PTPN2-PTPN1轴的抑制剂可以增强癌症细胞对IFN-γ的敏感性，并促进免疫细胞激活，在ICB耐药癌症的小鼠模型中诱导出强大的抗肿瘤免疫力。
PTPN2抑制剂的成功增强了我们探索靶向TNFAIP3治疗策略的兴趣。
TNFAIP3的OTU结构域包含几个可成药口袋，为小分子干预提供了机会。
此外，B细胞、树突状细胞和巨噬细胞中的细胞特异性TNFAIP3缺陷表现出不同的自身免疫表型，
这表明靶向TNFAIP3可能引发广泛的免疫激活，并为癌症患者提供临床益处，类似于PTPN2-PTPN1抑制剂所观察到的效果。
除了小分子药物外，创新的靶向策略如RNA干扰（RNAi）和蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）为在治疗干预中靶向TNFAIP3提供了有前景的方法。

Para_05

失调的炎症和细胞因子通路导致自身免疫性疾病。
我们的基因组分析揭示了TNFAIP3改变可以改善癌症预后。
我们提出TNFAIP3介导免疫激活与抑制之间的平衡，某些改变可能诱发自身免疫，但同时可能降低癌症易感性。
自身免疫疾病源于免疫系统异常激活。
虽然自身免疫反应通常对人类健康有害，但它们可能会相反地减轻癌症发展的风险，这一假设需要进一步研究。
此外，需要全面研究来阐明与癌症预后相关的自身免疫遗传变异的关系。
此外，针对与自身免疫相关的基因进行策略性靶向可能代表了一种激活癌症患者免疫系统对抗肿瘤的方法，这一概念需要系统性的探索。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_06

这项研究的一个局限性是ICB RNA-seq数据中可能存在批次效应，这些数据是从各种来源收集的。
为了解决这个问题，我们应用了分位数标准化和ComBat，这两种方法已被证明可以减轻转录组学数据集中的批次效应。
然而，我们承认批次效应无法完全消除。
因此，基因表达比较在一个单独的研究内部比在不同研究之间更可靠。
另一个局限性是对TNFAIP3-TNIP1复合物除TNF诱导的细胞凋亡和NF-κB调节之外的更广泛功能的理解还不完全清楚。
TNFAIP3-TNIP1复合物的结构细节及其与其他分子的相互作用也仍不清楚，这突显出需要进行全面的生化研究来阐明这些机制。

Resource availability

Lead contact

主要联系人

Para_01

进一步的信息和资源及额外数据的需求应联系主要联系人Zexian Zeng(zexianzeng@pku.edu.cn)，并将由其满足。
,

Materials availability

材料可用性

Para_01

本研究没有产生新的独特试剂或特定生物材料。
本研究中使用和产生的材料可在"STAR方法"部分找到。
本研究的数据和代码公开可获取，并在"数据和代码可用性"部分有所描述。

Data and code availability

数据和代码可用性

Para_01

本研究中使用的数据和代码可以从以下来源获取：CRISPR筛选数据集从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收集或由相应的作者慷慨提供。
ICRAFT中筛选比较的元数据可以在表S1中找到。
人类单细胞RNA测序数据集从GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和ArrayExpress（https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）获得。
这些数据集的登录号在表S2中提供。
ICB临床试验队列的RNA测序数据包含患者生存和免疫治疗反应信息，来自已发表的研究，具体细节见表S3。
1,208个癌细胞系的RNA测序数据和373个癌细胞系的蛋白质组学数据从DepMap门户（https://depmap.org/portal/download/all/）下载。
基于1,095个CRISPR-Cas9必需性筛选数据集的基因依赖水平从DepMap 2023 Q2版本（https://depmap.org/portal/download/all/）获得。
TCGA队列的转录组数据和临床数据从TCGA数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）获得。
结直肠癌和乳腺癌样本的处理空间转录组学数据从10x Genomics网站（https://www.10xgenomics.com/datasets/human-colorectal-cancer-whole-transcriptome-analysis-1-standard-1-2-0 和 https://www.10xgenomics.com/resources/datasets/human-breast-cancer-ductal-carcinoma-in-situ-invasive-carcinoma-ffpe-1-standard-1-3-0）下载。
泛癌CD8+ CTL的处理基因表达数据从GEO: GSE156728获得。
97个癌症队列中的31,127名患者的生存数据和基因型信息通过cBioPortal（https://www.cbioportal.org/）获得。

Para_02

本论文中的CRISPR筛选数据、单细胞RNA测序数据和ICB治疗RNA测序数据可以通过ICRAFT网络服务器访问：https://icraft.pku-genomics.org/。
本研究中的RNA测序数据已存入NCBI GEO：GSE261915。
为ICRAFT开发的爬虫和解析器的Python代码可以在GitHub上获取（https://github.com/zenglab-pku/ICRAFT_A20_paper）。

Acknowledgments

Para_01

这项工作得到了中国国家自然科学基金（92374116、32470664、82341026和12226005）以及北京大学-清华大学生命科学联合中心（Z. Zeng和D.P.）的支持。
我们真诚地感谢已发表研究的作者们分享了他们的CRISPR筛选、单细胞RNA测序、免疫检查点临床试验和空间转录组学数据。
作者感谢北京大学蛋白质科学国家中心、行为实验室，特别是田永禄博士在技术上的帮助。
部分分析是在北京大学生命科学联合中心高性能计算平台上进行的。
我们感谢北京大学定量生物学中心提供的实验平台。

Author contributions

Para_01

概念化由C.L.、D.P.、Z.G.和Z.曾完成；方法论由C.L.、R.Z.、R.G.、L.W.、Z.G.、D.P.和Z.曾共同完成；软件开发由C.L.、Y.H.、Y.J.和P.Z.负责；正式分析由C.L.、R.Z.和R.G.进行；调查研究由C.L.、R.Z.、R.G.、L.W.、T.X.、Y.H.、Y.J.、Y.Z.、P.Z.和X.L.共同完成；原始草稿撰写由C.L.、R.Z.、R.G.、D.P.和Z.曾完成；审查与编辑由C.L.、R.Z.、R.G.、S.Y.、W.Z.、C.W.、L.L.、Q.P.-H.、K.W.W.、Z.G.、D.P.和Z.曾共同完成；资金获取由D.P.和Z.曾负责；资源由C.L.、R.Z.、R.G.、T.X.、Z.张、P.Z.、X.L.、D.L.、Z.G.、D.P.和Z.曾提供；数据整理由C.L.、L.W.、Y.Z.、Z.G.和D.L.完成；可视化由C.L.、R.Z.和R.G.完成；监督工作由Z.G.、D.P.和Z.曾负责。
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Declaration of interests

Para_01

D.P. 收到了来自拜耳公司和勃林格殷格翰公司的赞助研究基金。这些资助与本研究中报告的研究无关。
K.W.W. 在 T-Scan Therapeutics、SQZ生物科技公司、Bisou生物科学公司、DEM BioPharma 和 Nextechinvest 的科学咨询委员会任职，并且他从诺华公司获得了赞助研究基金。
他是生物技术公司 Immunitas 的联合创始人。
以上活动与本出版物中报告的研究无关。

STAR★Methods

Key resources table

关键资源表

Experimental model and study participant details

实验模型和研究参与者详情

Animal studies

动物研究

Para_01

所有实验均使用年龄为6至8周的无特定病原体（SPF）小鼠进行。
OT-1-Cas9小鼠是Pan实验室惠赠的。
野生型C57BL/6小鼠购自北京大学健康科学中心实验动物科学部，北京，中国。
所有小鼠均按AAIS-ZengZX-1协议饲养和处理，该协议已获得美国实验室动物评估与认可协会（AAALAC国际）及北京大学实验动物管理和使用委员会（IACUC）的批准。
小鼠饲养于无菌设施中。

Cell lines

细胞系

Para_01

B16F10、MC38、LLC、A549、PANC1和HEK293T细胞系是来自潘实验室（清华大学的邓潘）的友好馈赠，这些细胞系在DMEM（Gibco，货号C11995500BT）中培养。
SW480细胞同样来自潘实验室，它们在RPMI 1640培养基（Gibco，货号C11875500BT）中培养。
SW620（货号CTCC-001-0353）和SNU398（货号CTCC-400-0145）细胞购自美森CTCC，它们在DMEM中培养。
所有的DMEM和RPMI 1640都添加了10%的胎牛血清（FBS，Biological Industries，货号04-001-1ACS），100 μg/mL青霉素和100 U/mL链霉素（1%青霉素-链霉素，Thermo，货号15140122）。
所有细胞系均在含有5%二氧化碳的37°C条件下培养。

Method details

方法细节

Generation of genetically ablated cancer cell lines and T cells

基因敲除癌细胞系和T细胞的生成

Para_01

为了生成sgTNFAIP3、sgTNIP1和sgCtrl癌细胞系，将靶向TNFAIP3、TNIP1或非编码间插序列的sgRNAs克隆到LentiCRISPR v2载体（RRID: Addgene_52961）中，并通过桑格测序进行验证。
使用54 μL PEI在Opti-MEM（Gibco，Cat# 31985070）中，通过共转染9 μg sgRNA构建体、6 μg psPAX2（RRID: Addgene_12260）和3 μg pMD2.G（RRID: Addgene_12259），每个10厘米培养皿产生慢病毒。
转染后48小时收获病毒，并用于感染B16F10、MC38、LLC、SW620、SW480、A549、PANC1和SNU398细胞。
应用嘌呤霉素选择以建立基因敲除的细胞系。
LLC-OVA细胞系通过慢病毒感染被工程改造以稳定表达全长OVA。
SW620、SW480、PANC1和SNU398细胞均表达内源性HLA-A2等位基因，这些细胞被感染了携带与eGFP相连的NY-ESO-1抗原的慢病毒（RRID: Addgene_126686）。
为了构建A549-NY-ESO-1细胞，慢病毒构建体编码了HLA-A∗02:01重链，该重链对于呈递NY-ESO-1抗原给本研究中使用的NY-ESO-1特异性TCR是必需的。

Para_02

为了进行T细胞编辑，将针对Tnfaip3或非编码间插序列的sgRNAs插入PMY-sgRNA-GFP载体，并通过桑格尔测序进行了验证。
逆转录病毒是通过共转染每10厘米培养皿9微克sgRNA构建体和9微克包装质粒，在Opti-MEM中使用54微升PEI来产生的。
转染后48小时收获病毒。
OT-1 T细胞如下面所述被激活，然后通过自旋感染进行逆转录病毒感染以引入sgRNAs。
通过FACS分选GFP+细胞，并通过western blot验证了基因删除效率。

Para_03

sgRNA的序列如下：

Para_04

sgCtrl 在小鼠细胞中的序列：AGAGATGAGACAAACTACCC。
记住，直接给我整理的结果，不要有除了结果的其他任何语句。
一般情况下，待整理原本有多少句话，输出的 json 就有多少个 item。

Para_05

sgCtrl 在人类细胞中的序列：CATATAAGTGCTTACCAATG。
让我们一步一步地思考。
记住，直接给我整理的结果，不要有除了结果的其他任何语句。
一般情况下，待整理原本有多少句话，输出的 json 就有多少个 item。

Para_06

sgTnfaip3-1 在小鼠癌细胞中的序列：GCAGCTTGTCAGTACATGTG。
let's think step by step.

Para_07

sgTnfaip3-2 在小鼠癌细胞中的表达：ATATCCATGAGTGATAGCTG。
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Para_08

sgTNFAIP3-1 在人类癌细胞中的作用：CCACTTGTTAACAGAGACCG。
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Para_09

sgTNFAIP3-2 在人类癌细胞中的作用：TATGCCATGAGTGCTCAGAG。
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sgTnfaip3-1 在小鼠 T 细胞中的序列：GCCCCGAGGAAACCGCTGG。
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sgTnfaip3-2 在小鼠 T 细胞中的序列：GCAGCTTGTCAGTACATGTG。
let's think step by step.
sgTNIP1-1 在人类癌细胞中：CAAGTCCAAGATTGAAATGG。
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sgTNIP1-2 在人类癌细胞中：ATCAGGTTGCCGTCCTCACG。
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sgTnfrsf1a 在小鼠癌细胞中的表达：AGTTGCAAGACATGTCGGAA。
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CD8+ T cell activation and proliferation experiments

CD8+ T细胞激活和增殖实验

Para_01

Primary OT-1-Cas9细胞是从OT-1-Cas9小鼠的脾脏和淋巴结中使用MojoSort™小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒（BioLegend，货号480007）提取的，根据制造商的协议进行操作。
将细胞接种在6孔板中，并用抗小鼠CD28（Bio X Cell，货号BE0015-1，RRID: AB_1107624）和抗小鼠CD3（Bio X Cell，货号BE0001-1，RRID: AB_1107634）抗体激活24小时。
激活的小鼠OT-1-Cas9细胞通过旋转感染使用逆转录病毒转导sgRNA，并在小鼠T细胞培养基（RPMI 1640含10%胎牛血清，20 mM HEPES，1 mM丙酮酸钠，0.05 mM 2-巯基乙醇，2 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中培养7天后与癌细胞共培养。
人CD8+ T细胞是从外周血单核细胞中使用EasySep™人CD8+ T细胞分离试剂盒（Stem Cell，货号17953）分离的，并在纤维连接蛋白存在下用抗人CD3（BioLegend，货号317326）和抗人CD28（BD Biosciences，货号555725）抗体激活。
激活的人类CD8+ T细胞通过旋转感染进行慢病毒转导，引入NY-ESO-1特异性TCR。
然后这些细胞在人类T细胞培养基（RPMI 1640含10%胎牛血清，1 mM丙酮酸钠，2 mM L-谷氨酰胺，2 mM GlutaMAX，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中补充10 ng/mL重组人IL-2（R&D Systems，货号202-IL-500）进行扩增。

sgTNFAlP3 A549 or OT-1 cells bulk RNA-Seq samples preparation

A549 或 OT-1 细胞批量 RNA 测序样品制备

Para_01

SgCtrl或sgTNFAIP3 A549细胞使用RNAsimple总RNA试剂盒（TIANGEN，货号DP419）根据制造商的说明进行了总RNA提取。
为了比较sgCtrl和sgTnfaip3 CD8+ T细胞的转录谱，我们将sgCtrl或sgTnfaip3 CD8+ T细胞与OVA肽（257-264 aa，SIINFEKL）脉冲处理的LLC细胞共培养了4小时。
然后通过FACS对CD8+ T细胞进行分选，随后按照制造商的方案提取总RNA。
每项实验中的RNA样本被送往安诺瑞德基因科技有限公司进行测序。
使用1∼3 μg的RNA，按照制造商的指导方针，使用VAHTS通用V6 RNA-Seq文库制备试剂盒（Illumina®，货号NR604-01/02）制备RNA-Seq文库。

CD8+ T cell cytokine production experiments

CD8+ T细胞细胞因子生产实验

Para_01

幼稚OT-1T细胞从OT-1转基因小鼠的脾脏中使用MojoSort小鼠CD8+T细胞分离试剂盒分离出来，并按照先前所述的方法进行激活和扩增。
在细胞因子生产测定中，Tnfaip3缺失的OT-1T细胞和对照编辑的OT-1T细胞在激活后7到12天内与100ng/mL的OVA肽（257-264aa，SIINFEKL）一起在含有5μg/mL布雷菲德菌素A（BFA；BioLegend，货号420601）的情况下孵育4小时。
然后收集细胞用于细胞内染色。
首先，它们在PBS中用Zombie-NIR固定可染色活力检测试剂盒（BioLegend，货号423106）染色5分钟，然后在室温下（RT）在流式细胞术缓冲液（PBS+5%FBS）中用PE抗小鼠CD8抗体（BioLegend，货号100707）染色15分钟。
在细胞内细胞因子染色前，细胞使用细胞内固定和渗透缓冲液套装（Invitrogen，货号88-8824-00）进行固定和渗透。
然后它们在渗透缓冲液（Invitrogen，货号00-8333-56）中用APC抗小鼠干扰素γ（BioLegend，货号505809）在室温下染色15分钟，并通过流式细胞术分析。

CD8+ T cell target killing experiments

CD8+ T细胞靶向杀伤实验

Para_01

为了在小鼠细胞系中的体外竞争实验，sgCtrl小鼠癌细胞被用CFSE（BD Bioscience，货号565082）标记，与sgTnfaip3细胞混合后种植于12孔板中。
细胞贴壁后，用OVA肽（257-264氨基酸，SIINFEKL）刺激2到4小时。
随后，这些细胞与sgCtrl或sgTnfaip3 OT-1 T细胞以指定的E:T（效应细胞与靶细胞）比例共培养。
在人细胞中，sgCtrl SW620-NY-ESO-1、SW480-NY-ESO-1、A549-NY-ESO-1、PANC1-NY-ESO-1和SNU398-NY-ESO-1细胞被用CTV（Invitrogen，货号C34557）标记，与相应的sgTNFAIP3细胞混合，并与NY-ESO-1特异性TCR-T细胞以指定的E:T比例共培养。
24到48小时后，收获癌细胞并通过流式细胞术进行分析，使用APC抗小鼠CD45抗体（BioLegend，货号103112）或APC抗人CD45抗体（BioLegend，货号304012）区分T细胞。
DAPI（Cell Signaling Technology，货号4083S）或Zombie染料（BioLegend，货号423106）用于鉴定死细胞。

Cell apoptosis staining assay

细胞凋亡染色检测

Para_01

在每个12孔板的孔中接种了50万癌细胞，并用TNF处理24小时。
处理后，收集细胞并按照制造商的说明使用PE标记的Annexin V凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen™，货号559763）进行染色，然后通过流式细胞术进行分析。

Mouse tumor inoculation experiments

小鼠肿瘤接种实验

Para_01

通过将1×10^6个LLC细胞或1×10^6个MC38细胞重新悬浮在100 μL PBS中，皮下注射到C57BL/6小鼠体内建立了小鼠肿瘤模型。
对于抗PD-1治疗，在肿瘤接种后第9天，向小鼠腹腔内注射200 μg抗PD-1抗体（Bio X Cell, Cat# BE0273, RRID: AB_2687796）或同型对照抗体，然后每3天注射一次直至第15天（共注射3次）。
对于OT-1 T细胞过继转移实验，将3×10^6个sgCtrl或sgTnfaip3 T细胞重新悬浮在100 μL PBS中，然后在第9天过继转移到携带LLC-OVA肿瘤的C57BL/6小鼠体内。
通过慢病毒转导稳定表达全长OVA抗原的LLC细胞系建立了LLC-OVA肿瘤。
未接受T细胞转移的对照组小鼠被注射了100 μL PBS。
一旦可以触及肿瘤，每隔3至4天测量一次肿瘤大小，使用（长×宽²）/2计算体积。
当肿瘤最长直径达到2.0 cm或小鼠死亡时设置终点。
尽可能地，年龄和性别匹配的小鼠进行了随机化。
在可行的情况下，研究者在测量肿瘤大小时对样本分配进行了盲法处理。

Tumor-infiltrating lymphocyte analysis

肿瘤浸润淋巴细胞分析

Para_01

肿瘤组织被切除，并用Ⅳ型胶原酶（Sigma-Aldrich，货号C5138），Ⅳ型脱氧核糖核酸酶（Sigma-Aldrich，货号D5205）和Ⅴ型透明质酸酶（Sigma-Aldrich，货号H6254）在5 mL RPMI1640中消化，在gentleMACS™ C管（Miltenyi Biotec，货号130-093-237）中于37°C下孵育30分钟，然后通过gentleMACS处理。
通过将消化后的组织过滤过70 μm细胞滤网获得单细胞悬液。
我们使用了Zombie-NIR固定可染色活力检测试剂盒（BioLegend，货号423106）在PBS中对细胞进行染色，然后用抗小鼠CD16/32（BioLegend，货号101320，RRID: AB_1574975）封闭IgG Fc受体。
随后，细胞进行了表面标记染色，然后经过固定和透化处理，以便进行胞内染色。
使用的抗体如下： Brilliant Violet 421™抗小鼠CD45（BioLegend，货号103133），FITC抗小鼠CD3（BioLegend，货号100204），PE抗小鼠CD8a（BioLegend，货号100708），APC抗小鼠CD4（BioLegend，货号100412），以及PE/Cy7抗颗粒酶B（BioLegend，货号372214）。
细胞通过Beckman CytoFLEX S进行分析。

Western blot analysis

西方墨点分析

Para_01

细胞被收集并在裂解缓冲液（碧云天，货号 P0013）中裂解。
使用 Bca 蛋白测定试剂盒（Solarbio® 生命科学，货号 PC0020）测定了蛋白质浓度。
将 20 μg 总蛋白加载到 SDS-PAGE 凝胶上，并转移到 PVDF 膜上。
膜在室温下用 5% 的脱脂奶粉封闭 1 小时，然后在 4°C 下与指定的一抗孵育过夜。
随后在室温下与二抗孵育 1 小时。
印迹用 M5 HiPer ECL Western HRP 底物（美五生物科技，货号 MF074-01）孵育，并使用 ChemiDoc™ 成像系统（伯乐实验室）捕获图像。
使用的抗体如下：A20/TNFAIP3 单克隆抗体（Cell Signaling Technology，货号 5630；Abcam，货号 ab92324），β-肌动蛋白兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology，货号 4970L；作为上样对照），以及 ABIN-1（TNIP1）抗体（Cell Signaling Technology，货号 4664）

Co-immunoprecipitation (Co-IP)

Para_02

为了进行共免疫沉淀实验，细胞要么用TNF处理要么不处理，处理时间按指示进行，然后收获并在裂解缓冲液（碧云天，货号P0013）中裂解。
细胞裂解物先用20 μL蛋白G珠子在4°C下预处理1小时，然后在4°C下与含有20 μL蛋白G珠子的1 mg抗Tnfaip3或抗RIPK1抗体一起免疫沉淀过夜。
随后，珠子用裂解缓冲液洗涤三次，然后煮沸并进行western blot分析。
使用的抗体如下：抗RIPK1（Cell Signaling Technology，货号3493），抗FADD（Santa Cruz Biotechnology，货号sc-271748），抗caspase8（Cell Signaling Technology，货号4790S），正常兔IgG（Cell Signaling Technology，货号2729）。

Immunofluorescence

Para_02

LLC细胞在12孔板中的玻璃盖玻片（NEST，货号801010）上培养，并用TNF处理了1小时。
然后，细胞在室温下用4％多聚甲醛（Beyotime，货号P0099）固定30分钟，接着在冰上用2％Triton X-100透化10分钟，再用1％牛血清白蛋白封闭30分钟。
使用稀释比例为1:200的一抗Anti-Tnfaip3（Proteintech，货号66695-1-Ig）和Anti-Tnip1（Cell Signaling Technology，货号4664）进行染色1小时，随后使用二抗（Invitrogen，货号A-11005；Invitrogen，货号A-11008）在1:200稀释度下染色1小时，并保持避光。
然后，细胞用0.1 μg/mL的DAPI（Thermo，货号62248）染色5分钟。
细胞用抗荧光淬灭封片剂（Beyotime，货号P0126）封片，并使用Leica显微镜（Leica，TCS SP8）成像。

Statistical analysis

统计分析

Para_01

统计分析通过使用 GraphPad Prism 9 软件（RRID: SCR_002798）进行，采用未配对的学生 t 检验、单因素方差分析或双因素方差分析（ns：不显著，∗P<0.05，∗∗P<0.01，∗∗∗P<0.001，∗∗∗∗P<0.0001）。
体外实验的组大小基于先前实验变异性经验设定。同样地，体内实验的组大小基于与相应肿瘤模型相关的先前经验设定。

Quantification and statistical analysis

量化和统计分析

CRISPR screen dataset collection and preprocessing

CRISPR筛选数据集的收集和预处理

Para_01

开发了一个Python爬虫和解析器来从基因表达全景数据库(GEO)检索数据集，覆盖了从2014年到2022年的研究。
搜索策略利用关键词的逻辑组合来识别数据集。
关键词包括"规模相关"术语如"全基因组"和"全基因组规模"；"技术相关"术语如"CRISPR敲除"，"CRISPR/Cas9"和"池化CRISPR筛选"；以及"免疫相关"术语包括"免疫"，"免疫肿瘤学"和"免疫治疗"。
这些关键词用于检索和过滤GEO数据集。
此外，开发了Python解析器从PubMed提取相关论文，采用与数据集关键词匹配相同的策略应用于论文摘要。
在编制了一份全面的免疫相关的CRISPR筛选研究列表后，如果公开可用，则下载FASTQ文件，否则向相应作者请求。
当FASTQ文件不可用时，收集原始计数或标准化计数文件。
还获取了筛选库文件。
使用解析器提取了元数据，包括研究设计和样本信息。
进行了手动验证以确定数据集是否应纳入数据库。
从文献中整理了详细的元数据，包括扰动细胞模型、表型、处理条件、样本信息、文库设计和扰动技术。
此信息在ICRAFT中查询数据集时呈现。

Para_02

所有CRISPR筛选数据集均通过标准化流程MAGeCK进行处理。
序列读取通过MAGeCK"计数"功能进行修剪和映射到相应的文库，以量化sgRNA读取次数。
技术重复合并为一个单一样本，而生物学重复则作为单独样本处理但一起分析以估计变异。
对FASTQ文件和计数文件进行了质量控制分析。
所有对照sgRNA在下游分析前被赋予了唯一ID。
然后使用MAGeCK"测试"模块识别在处理组相对于对照组中富集或耗竭的靶向sgRNA的基因目标。
MAGeCK生成了sgRNA和基因的对数折叠变化（LFC）值，反映了它们在细胞群体中的相对富集水平。
鉴于来自不同研究的样品具有多样化的来源，为了减轻批次效应，在sgRNA层面使用z分数归一化来比较数据集。
对于CRISPR筛选的综合和比较分析，将所有小鼠基因符号转换为其人类同源物。
缺乏明确人类同源物的基因从分析中排除。
对于具有多个小鼠-人类映射关系的基因，在将小鼠基因转换为人类同源物时，我们通过保留排名列表中最高排名的人类同源物来消除冗余。

Para_03

所有在 ICRAFT 中的屏幕根据细胞类型进行了分类，区分了癌细胞和免疫细胞，并进一步根据研究设计进行了分类。
这导致了五个筛选类别，每个类别都有对基因失活效应的具体解释。
具体来说，在"细胞存活和增殖"类别中，负分表示基因删除抑制了细胞增殖，而正分则表明基因删除促进了细胞增殖。
在"按标记表达排序"类别中，负分表示基因删除降低了标记水平，而正分则表明基因删除增加了标记水平。
在"与免疫细胞共培养"类别中，负分表示基因删除增加了癌细胞对免疫细胞介导的杀伤的敏感性，而正分则表示基因删除降低了这种敏感性。
在"与其他细胞共培养"类别（针对免疫细胞的扰动）中，负分表示基因删除减少了免疫细胞活性（例如，T 细胞的增殖或细胞因子产生），而正分表示基因删除增加了免疫细胞活性。
在"体内 CRISPR 筛选"类别中，负分表示基因删除导致负选择，表明在体内被消除，而正分则表示基因删除导致正选择，表明在体内被富集。
为了保持展示一致性，我们已经反转了 CRISPR 激活筛选数据的显示方向。
例如，在一个排序筛选中，如果"基因 A"的过表达促进了标记表达，则我们的数据显示，"基因 A"的删除减少了标记表达（即，指导 RNA 的 LFC 值从正变为负）。
为了避免对筛选类型的误解，我们在图表和元数据表中明确标注了它是 CRISPR 激活扰动类型。

Human single-cell RNA-Seq collection and preprocessing

人类单细胞RNA测序数据收集与预处理

Para_01

ICRAFT 数据库包含 83 个高质量的肿瘤微环境（TME）scRNA-Seq 数据集，涵盖了 31 种癌症类型（表 S2）。
TME scRNA-Seq 数据集是从 GEO130 和 ArrayExpress131 收集的。
每个数据集的原始计数、FPKM 或 TPM（如果可用）表达矩阵被下载。
样本元数据，如患者 ID、组织起源和原始细胞类型注释，来自原始研究进行了整理。
对于包含多种癌症类型的每组数据集，每种癌症类型被单独处理和展示。
应用了一个标准化流程来减少由测序平台的技术差异、文库制备方法以及下游分析算法引起的系统偏差。
我们使用 Seurat v3.1.2124 进行质量控制和数据预处理，过滤掉了读取计数低于 1,000 或检测到的基因少于 500 的细胞。

Para_02

预处理后，根据测序平台的不同，应用了不同的归一化方法。
对于基于独特分子标识符（UMI）的技术（如10x Genomics、Drop-Seq和inDrop），使用全局缩放归一化将每个细胞的UMI计数标准化到10,000，然后进行对数变换以解决不同细胞间的测序深度差异。
对于通过Smart-Seq2平台生成的数据，直接在下游分析前进行对数变换。
当原始计数数据可用时，我们将其转换为TPM以实现标准化。
使用Seurat v3.1.2.124纠正批次效应。
最初，对每个数据集进行了特征选择，随后在多个数据集中进行了特征优先级排序。
然后，我们应用了典型相关性分析（CCA）来识别无监督条件下的数据集对之间的锚点。
计算数据集之间的成对距离，并用于层次聚类。
为了逐步纠正批次效应，我们在CCA子空间中计算了互近邻（MNNs）132。
批次效应校正后，应用了统一流形逼近和投影（UMAP）133进行降维。
使用Leiden134和Louvain135算法识别簇。
使用Wilcoxon检验识别簇间差异表达基因（DEGs）.

Para_03

恶性细胞簇通过结合原始研究注释和检查恶性细胞标记物表达（如上皮标记物（EPCAM、KRT8 和 KRT18））来确定。
正常细胞簇使用基于标记的方法在 MAESTRO136 中自动注释，该方法使用了不同簇之间的差异表达基因（DEGs）和已发表资源中的标记基因，例如，基质细胞（COL1A1、VWF 和 PLVAP）、髓系细胞（CD68、CLEC9A、CD1C 和 S100A9）、T 细胞（CD3D、SELL、CCR7、FOXP3、CTLA4 和 CD8A）以及 B 细胞（MZB1、IGHA1、CD19 和 AICDA）。
我们保留了 23 种常见的细胞类型。
在完成自动注释后，对所有注释的细胞类型进行了手动修正。
这个过程包括验证标记表达、将这些注释与原始细胞注释整合，以及在前一步骤中识别恶性细胞。

ICB clinical trial cohort RNA-Seq data collection and preprocessing

ICB临床试验队列RNA-Seq数据收集和预处理

Para_01

RNA-Seq 数据，患者生存情况和 18 个癌症免疫检查点阻断疗法临床试验队列的免疫治疗反应，由已发表的研究提供了共计 943 份治疗前肿瘤样本（表 S3）。
对于每个 RNA-Seq 数据集，转录组谱被进行了 log2(1+TPM) 转换并在患者之间进行了分位数标准化。
通过应用 ComBat 方法进一步去除了临床队列之间的批次效应，该方法已被证明能有效减少转录组数据集中的批次效应。
正如在一项基准研究中也提到的，分位数标准化与 ComBat 结合提供了稳健且可靠的批次校正结果。
根据响应状态对样本进行分层，并在各队列中响应者与非响应者之间应用 Wilcoxon 秩和检验来统计评估基因表达或特征评分的差异。
虽然批次校正解决了混淆因素，但它不影响组间表达水平的比较，而是提高了下游可视化在不同数据集中的协调性。

CCLE data collection and preprocessing

CCLE 数据收集和预处理

Para_01

我们从癌症依赖图谱（DepMap）门户（https://depmap.org/portal/download/all/）下载了1,208种癌细胞系的RNA-Seq数据和373种癌细胞系的蛋白质组学数据，该门户包含经过处理的基因或蛋白质表达数据以及细胞系元数据。
在我们的研究中，转录组学和蛋白质组学数据按每个细胞系的组织起源进行分组。
TNFAIP3在这类细胞系中的表达通过箱线图可视化，并根据中位数表达值从小到大排序。
为了在基因或蛋白质水平上进行相关性分析，我们计算了TNFAIP3与其他所有基因或蛋白质之间的皮尔逊相关系数，并应用错误发现率（FDR）校正以确保统计准确性。
为每个细胞系计算了TNFAIP3缺失特征得分，并随后根据所有细胞系中观察到的中位特征水平将其分类为高和低特征组。
通过平均每个细胞系中每条通路的基因表达来计算基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路得分。
高和低特征组中通路得分的分布通过拆分的小提琴图进行了分析和可视化。
使用FDR校正进行了线性回归分析，以评估所有细胞系中每个通路得分与TNFAIP3缺失特征得分之间的相关性。
这种方法提供了对TNFAIP3缺失特征水平与各种通路之间关联的全面理解。

Para_02

基于 2023 年第二季度发布的公共 CRISPR-Cas9 必需性筛选数据集（共计 1,095 个），TNFAIP3、PTPN2、SOCS1 和 GAPDH 基因的基因依赖水平从 DepMap 门户下载。
使用基因依赖水平 < -1 的截止值来确定共同必需的基因。
直方图通过从最小到最大基因依赖水平以 0.025 的间隔生成。
标记了基因依赖水平低于 -1 的细胞系的数量和百分比。

TCGA cohort data processing

TCGA队列数据处理

Para_01

转录组和临床数据从TCGA数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）获取了所有33种癌症类型的数据。
我们将乳腺癌数据集根据PAM50分类为基底型、lumA、lumB和Her2+亚型。
我们将HNSC数据集分为HPV+和HPV-亚型，还将SKCM分为原发性和转移性亚型。
我们使用xCell、QUANTISEQ、Cibersort和TIMER算法从bulk RNA-Seq数据估计肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。

CRISPR screen datasets integration analysis

CRISPR筛选数据集整合分析

Para_01

对于每个精选的CRISPR筛选数据集，MAGeCK"测试"模块通过基因扰动效应和不同引导序列之间的变异组合来对所有评估的基因进行排名。
为了整合来自多个大规模CRISPR筛选的结果，我们将这些排名的基因列表合并成一个列表，这可以被看作是一个列表聚合任务。
稳健等级聚合（RRA）是一种用于聚合等级数据的成熟方法，在这项研究中被用来整合来自CRISPR筛选结果的这些排名基因列表。
对于本研究中的癌症细胞综合分析，我们选择了基因库大小超过10,000个基因的筛选，并且前三个排名基因的MAGeCK统计量（FDR）低于0.2。
对于CD8+ T细胞筛选，我们对体外筛选应用了相同的评判标准。
然而，对于体内CD8+ T细胞筛选，我们使用了一个超过1,000个基因的基因库大小，并且采用了相同统计阈值。
缺乏明确的人类同源基因或在人类和小鼠之间有多重映射的基因被排除在综合分析之外。

Analysis of gene expression in spatial transcriptomics datasets

空间转录组学数据集中基因表达的分析

Para_01

预处理的空间转录组学数据可以从10x Genomics网站获取，网址为https://www.10xgenomics.com/datasets/human-colorectal-cancer-whole-transcriptome-analysis-1-standard-1-2-0。
结直肠癌（CRC）样本的预处理空间转录组学数据可以在该网站上获得。
乳腺癌（BRCA）样本的预处理空间转录组学数据是从10x Genomics网站获取的，网址为https://www.10xgenomics.com/resources/datasets/human-breast-cancer-ductal-carcinoma-in-situ-invasive-carcinoma-ffpe-1-standard-1-3-0。
质量控制是根据标准的Scanpy流程进行的。
含有超过20%线粒体基因计数的斑点和出现在少于10个细胞中的基因被过滤掉了。
进行了主成分分析（PCA）和UMAP降维。
使用Leiden算法在分辨率0.5下进行了聚类。
使用Scanpy v1.9.3中的scanpy.pl.spatial函数生成了空间特征表达图。
计算了CRC和BRCA数据集中每个簇中TNIP1和TNFAIP3的平均表达水平。
随后进行了皮尔逊相关性分析。

Bioinformatics and statistical analysis

生物信息学和统计分析

Over-representation enrichment analysis

Para_01

使用 Metascape 对基因列表进行了功能富集分析。
富集了生物过程、细胞组分和分子功能类别的 144 个 GO 条目，以及 KEGG 通路、Reactome 基因集和 CORUM。
计算了累积超几何 P 值和富集因子，并用于筛选。

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)

Para_01

为了描述不同表达或相关基因或蛋白质的功能，使用了基于来自差异表达分析或相关性分析的 LFCs 或相关系数的基因排名，通过 R 包 clusterProfiler v4.8.1 进行了 GSEA 分析。
KEGG 通路、GO 条目和 Reactome 基因集是从 MSigDB 收集的。
确定并展示了显示出显著上调或下调（FDR < 0.05）的关键通路。

Protein-protein interaction (PPI) network analysis

Para_01

为了阐明双重功能基因靶点之间的交互关系，进行了全面的蛋白质相互作用网络分析。
该分析涉及将所有双重功能基因靶点映射到STRING数据库v12.0148中，以可视化它们的相互作用网络。
目标是揭示这些靶点之间潜在的功能相互依赖性和通路。
随后，对构建的蛋白质相互作用网络进行了功能通路分析。
在分析网络时，特别关注子图，定义为网络中的较小互联群组。
我们保留了包含至少三个节点的子图。
每个子图选择了一个代表性通路进行注释。
这种注释基于与每个簇中蛋白质相关的最显著或相关生物通路。

Transcription factor inference

Para_01

我们使用LISA分析了来自A549细胞中TNFAIP3敲除的两组差异表达基因（DEGs），每组均符合FDR小于0.05和baseMean大于200的标准。
第一组包含89个上调基因，其倍数变化（LFCs）大于0，而第二组则由69个下调基因组成，其LFCs小于0。
LISA首先利用Cistrome数据库中的大量组蛋白标记和染色质可及性谱系来估计适合这些输入基因的表观遗传模型。
然后，它利用TF ChIP-seq数据和已知的DNA结合基序推断驱动转录因子。
这一分析导致两个基因列表中推断出转录因子和富集的基序，为理解TNFAIP3失活所影响的调控机制提供了见解。
对于Tnfaip3-null OT-1细胞，在初始阈值（FDR小于0.05和baseMean大于200）下仅得到63个基因。
为了适应这种情况，我们将参数调整为包括FDR小于0.05且倍数变化大于1的上调基因，共470个基因；以及倍数变化小于-1的下调基因，共86个基因。
这种修改的方法使得对Tnfaip3-null OT-1细胞中差异表达基因的更全面分析成为可能。
随后，对Tnfaip3-null OT-1细胞中的两组差异表达基因进行了相同的分析，以识别潜在的转录因子和DNA结合基序。

Pan-cancer tumor-infiltrating CD8+ T cells scRNA-Seq analysis

Para_01

所有处理过的泛癌CD8+CTL基因表达数据均来自GSE156728。
主要聚类通过标记基因进行注释，并保持与原始论文一致。
下游分析使用标准的Scanpy流程进行。

TNFAIP3-null signature analysis

Para_01

一个 TNFAIP3 缺失特征被建立来研究 TNFAIP3 缺陷的临床相关性，使用了 A549 细胞中的 89 个上调基因和 69 个下调基因（TNFAIP3 删除与邻近区域靶向删除对照，FDR<0.05 和 baseMean>200），LFCs 作为权重。
我们计算了每个输入表达谱的 TNFAIP3 缺失特征评分，以使用基于方程 S=∑(wi×Ei) 的签名基因表达加权和来估计 TNFAIP3 缺陷水平，其中 S 是特征评分，Ei 是第 i 个基因的表达水平，wi 表示相应的权重。
评估了 TNFAIP3 缺陷与免疫相关通路、肿瘤中 T 细胞浸润水平以及对 ICB 的反应之间的关联。

Multivariable logistic regression analysis

Para_01

为了应对CD8+ T细胞浸润的潜在混淆效应，我们构建了逻辑回归模型，以ICB反应作为结果变量，以TNFAIP3-null特征作为输入变量，并将CD8+ T细胞浸润水平作为混淆变量。我们将特征和CD8+ T细胞浸润水平都使用z分数标准化以确保可比性。使用虚拟变量调整了特定队列的影响。

Survival analysis

Para_01

生存数据和来自97个癌症队列的31,127名患者的基因型信息是通过cBioPortal（https://www.cbioportal.org/）获得的（表S8）。
总共分析了与自身免疫疾病相关的46个基因，如先前研究（100,101,102,103,104,105,106）报告的那样（表S8）。
使用Kaplan-Meier曲线评估了TNFAIP3基因型与总体生存率之间的关联，并计算了log-rank p值和95%置信区间。
采用Cox比例风险回归模型比较了自身免疫相关基因发生改变的患者与未发生此类改变的患者的总体生存率。
该模型调整了包括年龄、性别、种族和癌症类型在内的关键预后因素。
利用R包survminer v0.4.9生成了生存曲线用于可视化表示。