空间转录组学习笔记 - 第1周（初来乍到的Echo）

随着考研结束，距离入学还有一段时间，这段时间就来学习一下空间转录组的相关知识。菜鸟第一步，先上生信技能树，我是初来乍到的Echo，请大家多多批评与指教！后面读研的方向是病理AI~

📌 转录组测序技术发展

• RNA-seq：也就是Bulk RNA-seq，包括microarray和二代测序（NGS），是对组织中大量混合细胞进行RNA提取和测序，获得基因表达水平的平均值。它能够揭示组织/疾病状态下的整体基因表达特征，但会丢失细胞异质性信息。
• scRNA-seq：单细胞转录组测序通过分离单细胞，独立扩增并测序其RNA，将对基因表达的认知推进到单细胞层面，但单细胞悬液的获得需要对组织酶解，会破坏细胞的原生微环境，导致空间信息丢失，同时复杂形态细胞难以完整分离。
• Spatial Transcriptomics：空间转录组技术不需要制作单细胞悬液，可以在保留细胞空间位置信息的前提下测定细胞的基因表达，能够避免组织解离带来的基因表达扰动，支持难解离样本的直接分析，具有广泛的应用前景。

📚 空间转录组技术分类

1. Next-Generation Sequencing (NGS)-based 基于NGS的方法

基于NGS的方法源自scRNA-seq的概念创新，在文库制备前给不同位置的reads带上映射了空间信息的短序列，也就是空间barcode。主要包括ST、10x Visium，Slide-seq，HDST（high-definition），DBiT-seq，Stereo-seq，Seq-Scope，Pixel-seq等。

2016年，Stahl等人首次提出了一种基于NGS的空间转录组学（ST）方法，之后ST技术被10x Genomics公司收购并进一步开发，命名为 "10x Visium"。Slide-seq通过在橡胶涂层玻片上的独特DNA条形码微珠（类似于Drop-seq）实现mRNA的捕获，提高了分辨率到10μm级别，HDST技术通过替换Slide-seq中的微珠进一步达到亚细胞级2μm分辨率。DBiT-seq采用了微流体技术将polyT barcode应用于组织切片。Stereo-seq使用随机条形码DNA纳米球以阵列模式沉积，以实现纳米级分辨率。Seq-Scope已实现亚细胞分辨率。Pixel-seq使用源自多聚体的凝胶寡核苷酸阵列捕获RNA，与现有方法相比，分辨率提高了多达200倍。

2. Imaging-based 基于成像的方法

在基于成像的ST方法中，荧光信号由单个RNA分子在其天然位置生成，高分辨率荧光显微镜用于检测和区分来自不同RNA分子的单分子信号。不同方法的差异在于光学条形码的特性及其生成方法。这些差异反过来决定了这些技术的不同性能以及不同技术最适合解决的生物学问题范围。基于图像的空间转录组学可以简单分为两类：原位测序（in situ sequencing，ISS）和荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）方法。

原位测序方法直接读取组织内转录本的序列。具体来说，RNA先进行逆转录，再通过滚环扩增放大，最后进行测序。主要包括BaristaSeq，STARmap，FISSEQ，Barseq，HybISS，ExSeq等。

荧光原位杂交利用原位杂交技术，通过互补荧光探针的杂交来检测目标序列，最初可区分的转录本数量有限，但随着创新技术的发展，如连续轮次的杂交和成像，结合条形码技术，实现了显著的多重检测。主要包括MERFISH，smFISH，SeqFISH等。

对于ISS和ISH方法，图像被处理以生成基因表达矩阵。为了获得细胞水平的矩阵，图像需要进行分割，可以手动在小区域上操作，也可以系统地使用计算方法。虽然这些可能并不符合真正的物理边界，但它们完成了将每个mRNA分配给细胞的任务。或者，数据分析可以从单个像素水平开始，并结合基因表达数据来描绘细胞。

🧩 Visium空间转录组技术

1. 10x Visium

下图为10x Visium芯片（slide）结构，一张芯片上分4个样本捕获区域（Capture Areas），每个捕获区域的大小为6.5mm x 6.5mm，每个捕获区域上有近5000个捕获点（spot），每个点的直径是55μm，点之间的圆心距是100μm，每个点上都连接了带有标签序列的DNA链，序列包括：

（1）TruSeq Read 1：部分read1测序引物

（2）Spatial Barcode：16nt，每个spot会有一个单独的spatial barcode，特定位置的barcode相同，用于确定位置信息

（3）UMI：唯一分子标识符，用于在PCR之后识别单个序列

（4）poly(dT)：捕获mRNA的ployA尾进行cDNA合成

Visium芯片

Visium芯片

实验流程中，OCT包埋的新鲜冰冻切片被贴到芯片的捕获区域上进行透化，透化酶使组织切片变得可渗透，切片中的mRNA被释放出来，mRNA的ployA尾巴与ploy（dT）序列互补杂交，在逆转录酶的作用下逆转录出第一条cDNA链，经过一系列酶反应得到第二条cDNA链，第二条cDNA链不仅带有mRNA序列，还带有标签序列，对其进行PCR扩增，建库，测序，可以得到带有空间位置信息的基因表达谱数据。

Visium实验流程

Visium实验流程

2. Visium for FFPE

前面10x Visium中样本必须是新鲜样本，不能是FFPE石蜡样本，因为FFPE样本中的mRNA会有一定程度的降解，ployA尾巴很可能断掉了，为了解决检测FFPE石蜡样本的问题，10x公司推出了“FFPE Visium”，核心改变在于根据人和小鼠的已知基因序列设计靶向探针对，右侧探针带有30nt的ployA，探针对与它们的mRNA靶向位点杂交，杂交后在DNA连接酶的作用下，把探针对连接成一条DNA链，将连接反应代替逆转录反应，解决了FFPE样本中mRNA被降解成小片段的问题。

探针panel中，目前针对人设计了54,018 个探针靶向 18,536 个基因，针对小鼠设计了 55,538 个探针靶向19,405个基因，可以检测到人和小鼠绝大部分的mRNA。

探针杂交和连接

探针杂交和连接

3. 10x Visium HD

芯片上一个spot的直径为55μm，而一般细胞的直径在10-30μm之间，空间分辨率不够高，为了解决Visium空间分布率不高的问题，10x公司推出了Visium HD高分辨率空间转录组解决方案，在FFPE Visium的基础上，使用了全新的Visium HD芯片，芯片具有两个捕获区域，每个捕获区域的大小为6.5mm x 6.5mm，每个捕获区域被分为约1100万个2μm的条形码方块（barcoded square），每个方块上连接着带有标签序列的DNA链，包括TruSeq Read 1、Spatial Barcode、UMI和ploy（dT）。在数据分析中一般把16个条形码方块组合在一起形成一个8μm x 8μm的格子，使得Visium HD的空间分辨率达到和细胞直径在同一水平。

Visium HD芯片

Visium HD芯片

📖 参考文献

1. [Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics](Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics | Nature)
2. [The emerging landscape of spatial profiling technologies](The emerging landscape of spatial profiling technologies | Nature Reviews Genetics)
3. 10x Visium