文献分享---乳腺癌的空间分辨图谱揭示了微静脉niche控制淋巴细胞外渗的细胞间机制（Stereo-seq）

作者，Evil Genius

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知识积累

乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，其特征在于不同的分子亚型。

深入地了解TME异质性和决定免疫浸润的机制，以优化免疫治疗效果。

毛细血管后微静脉是淋巴细胞通过内皮屏障外渗的主要通道。

肿瘤生态系统及其血管系统的高分辨率、无偏空间图有助于阐明免疫系统和血管系统之间复杂的空间和功能网络。

结果1、描绘人类乳腺癌的高分辨率空间图谱

23名乳腺癌患者的30个新鲜冷冻组织采用Stereo-seq，包括23个原发性乳腺癌和7个成对的转移性淋巴结，它们共同涵盖了所有四种分子亚型。对相邻肿瘤组织进行scRNAseq以促进ST载玻片中的细胞类型鉴定（还有免疫荧光数据）。

单细胞的marker注释

Stereo-seq数据分析，bin50. 单细胞空间联合，RCTD。

结果2、内皮异质性的特征揭示了微静脉内皮细胞的免疫调节功能

内皮细胞在血管生成、免疫浸润和乳腺癌微环境的形成中起着至关重要的作用。值得注意的是，肿瘤内皮细胞表现出广泛的表型差异，这与其解剖定位一致。

内皮细胞再分群分析，venular ECs (ACKR1, PLVAP), arterial ECs (IGFBP3), and capillary ECs (PLVAP)。

利用ST数据识别和空间定位EC及其亚型。使用0.1作为EC的RCTD细胞类型评分的阈值，并成功地在ST切片上识别出sporadic ECs。这些EC与相邻载玻片上通过IHC识别的CD31阳性EC完全对应。

结果3、不同内皮细胞亚型的不同微环境

为了研究不同EC亚型的环境，分别测定了含有EC的每个bin 50spot（bin 50模型）及其相邻的8个bin 50spot（bin 150模型）中的细胞组成，从而获得了30个ST载玻片上EC周围各种相邻细胞的组成。通过富集分数（ES）和标准化富集分数（NES）来量化EC与其他主要细胞类型之间的邻近关系。

在原发性肿瘤和淋巴结转移的bin 50/bin 150模型中，微静脉EC分别位于T/NK细胞附近。为了全面了解微静脉内皮细胞独特的免疫环境，计算了ES，以比较乳腺癌微环境中不同细胞周围三种EC亚型的prevalence。与毛细血管或动脉相比，只有小静脉在空间上接近T/NK细胞和B细胞，在不同的肿瘤亚型（乳腺癌的分子亚型）、肿瘤位置（原发性肿瘤和淋巴结转移）、分析空间（bin 50和bin 150模型）或邻近模型（ES和NES）中表现出显著的稳定性。

为了准确评估不同EC亚型与每个免疫细胞之间的空间关系，分别计算每个T细胞或NK细胞与周围EC之间的欧氏距离，从而识别与每个免疫细胞最近的EC亚型。因此，通过比较不同EC亚型作为最近细胞的流行率，我们证实了T细胞和NK细胞在空间上与小静脉EC最接近。

通过ST切片上的原位投影，还直观地证实了EC亚型与肿瘤细胞和免疫细胞的独特共定位模式：大多数毛细血管分布在肿瘤内部，而小静脉则主要聚集在T/NK和B细胞周围。此外，来自相邻切片的mIF结果证实了这些观察结果，表明T、B和NK细胞在小静脉周围大量聚集，类似于三级淋巴结构（TLS）。TLS已被广泛报道促进适应性免疫应答并在增强肿瘤免疫浸润中起关键作用。从而调节免疫治疗的功效. 通过将H&E染色结果与空间细胞注释图相结合，在七种原发性肿瘤的ST载玻片中鉴定了TLS样组织。值得注意的是，结果表明，小静脉内皮细胞几乎完全构成了TLS内的血管网，而在TLS外，与TLS距离最近的小静脉内皮细胞比例较高，提示小静脉内皮细胞与免疫细胞的聚集和TLS的形成密切相关。

结果4、微静脉SMC的空间定位和生物学表型与微静脉EC相协调

内膜内皮细胞和外膜平滑肌细胞共同构成血管的主体，两者在空间和功能上密切相关，参与多种生理过程。

SMC异质性分析。

每个样本中SMC亚型的定量显示，在ST切片上，小静脉SMC的比例高于动脉SMC。此外，淋巴结转移显示小静脉SMC的含量显著高于原发性病变，与小静脉EC中观察到的趋势相同。

当分析小静脉SMC附近的免疫细胞时，我们发现小静脉SMC周围淋巴细胞富集，特别是，发现CCL 21+小静脉SMC与T/NK细胞、B细胞和巨噬细胞非常接近。

小静脉SMC大量存在于免疫细胞聚集的区域。

结果5、乳腺癌患者静脉成分与淋巴细胞浸润和临床预后相关

使用单细胞数据集定义亚型特异性标记基因，然后将这些标记应用于两个大型乳腺癌队列，以估计患者中微静脉成分的比例。结果表明，高比例的微静脉EC或SMC与改善的总生存率（OS）显著相关，如METABRIC和TCGA队列中所观察到的。

结果6、微静脉内皮细胞和平滑肌细胞协调促炎性血管niche的细胞间机制

对仅含有微静脉EC或仅含有微静脉SMC的点与含有两种细胞类型的点进行了差异分析，总共产生了194个DEG。

利用CellChat对scRNA-seq进行细胞通讯分析，测试了这些LRI在包含相应细胞类型的空间位置中的共存，并最终过滤出8个空间共定位的LRI。

As expected, we observed that EC monolayers with ACKR1 overexpression significantly elevated the transmigrating ability of PBMCs under CCL2 or CCL5 chemotactic stimulation. This highlights the crucial role of the ACKR1-mediated intercellular signal communication within the venular niche in promoting immune infiltration.

基于微静脉niche及其周围细胞在生物学表型、空间组织和细胞间通讯方面的协同关系，最终可以推测ACKR1+ EC和CCL21+ EC之间相互作用的分子机制。SMCs协同促进免疫浸润，淋巴细胞表面的CCR7受体在介导免疫细胞迁移和浸润中起关键作用其趋化因子配体CCL21和CCL19。CCL 21+微静脉SMC是这些趋化因子的真正来源，可以募集循环淋巴细胞进入血管，同时微静脉EC表面的ACKR 1受体不同于典型的趋化因子受体;当与趋化因子配体结合时，ACKR 1不激活细胞内信号传导，而是内化和转运这些配体，ACKR 1介导的配体结合和呈递有助于内皮连接内的趋化因子“储存”，导致淋巴细胞从管腔向近管腔迁移。在这种情况下，当淋巴细胞被微静脉SMC释放的CCL 21/CCL 19吸引到微静脉niche时，ACKR 1+微静脉EC通过ACKR 1结合来自T/NK或B细胞的CCL 5配体和来自微静脉SMC的CCL 2配体，促进微静脉SMC和淋巴细胞之间的近距离通信并产生富含化学动力学的血管niche，其中淋巴细胞有效地被激活并通过微静脉壁迁移以参与肿瘤内的抗肿瘤反应。

最后看看方法

单细胞数据预处理

单细胞标准分析，cellchat分析细胞通讯。

单细胞空间联合分析RCTD

细胞距离分析

共定位分析

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