文献解析18 单细胞组学揭示了C3及C4植物中影响光合作用的保守调控元件

这篇文章于2024年11月20日发表于《Nature》杂志，主要探讨了通过单细胞组学技术研究水稻和高粱叶片发育过程中C3和C4途径调控机制。

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文章链接为：https://www.nature.com/articles/s41586-024-08204-3。研究由剑桥大学Julian M. Hibberd教授领导的团队完成。

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摘要

地球上大多数高产植物通过C4途径进行光合作用，相较于原始的C3途径，C4途径的光合效率提高了50%。维管束鞘细胞在激活光合作用中扮演了关键角色。然而，维管束鞘细胞如何执行光合调控功能尚不明确。本研究通过单细胞RNA测序(sc-RNAseq)和单细胞转座酶可及性染色质测序(sc-ATACseq)，揭示了C4叶片中维管束鞘细胞基因表达的变化与C3叶片中已知的顺式调控元件相关。研究发现，在C3植物水稻和C4植物高粱中，DOF motif在维管束鞘细胞中定位，并能调控光合作用的发展。在高粱中，大多数受光合作用调控的高表达基因都受到DOF motif的调控。这些转录因子在不同细胞间稳定表达，并能在C3和C4植物叶片的维管束鞘细胞中激活光合作用。本研究结果为理解复杂的C4途径进化提供了分子层面的见解，并为指导C3和C4作物的生长发育提供了理论基础。

研究背景

在多细胞生物中，基因表达模式的改变推动了细胞功能和性状的进化。例如，在60多种植物谱系中观察到，有效的C4通路可以通过调控C3途径的细胞转化而来。在大多数陆生植物中，二氧化碳的固定发生在叶肉细胞中，并依赖于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）。由于RuBisCO的第一个固定产物是三碳化合物，这一途径被称为C3光合作用。虽然大多数陆生植物使用C3途径，但RuBisCO并不能完全区分二氧化碳和O2。在包括玉米和高粱在内的多种主要植物谱系中，进化重新配置了叶肉和束鞘细胞的功能，使得RuBisCO的二氧化碳固定在叶肉中被抑制，在维管束鞘中被激活。这一过程导致维管束鞘中叶绿体中二氧化碳浓度增加10倍，从而减少氧化反应，进而提高光合以及水和氮的利用效率。因此，C4植物在炎热和干燥环境中可以良好生长，其中包含多个世界上高产的作物品种。

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在C3和C4植物中，光合效率取决于叶片不同细胞类型基因表达差异。然而，到目前为止，只鉴定到几个控制C4基因细胞特异性表达的顺式元件。目前对于不同细胞类型之间如何进行光合调控是未知的，也不清楚C4模式怎样从C3途径进化而来的。因此作者为了解析这个问题，选择大约8100万年前分化的单子叶植物的不同分支C3植物水稻和C4植物高粱进行研究，进而构建单细胞的基因表达和染色质可及性图谱，解析光合调控基因。

水稻和高粱的单核图谱

通过对不同组织进行观察，发现在这段时间内茎部组织发生了光形态建成，叶片出现，叶绿素在其中积累脱黄化的前12小时。扫描电镜（SEM）结果显示，在光照前，叶肉细胞和束鞘细胞的黄原体均含有前板层小体。在光照下的12小时内，叶黄体转化为成熟的叶绿体，并组装成类囊体膜。与水稻相比，高粱束鞘的叶绿体发育更为明显，高粱叶肉和束鞘细胞的叶绿体的类囊体堆积存在明显差异。

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在这其中的细胞类型转变，主要是由基因调控的。这些生物学现象可以清晰在组织间观察到，但对于其内在机理了解甚少。作者进行水稻和高粱叶片发生光形态建成阶段进行转录组学单核图谱构建。分别得到了来自水稻和高粱的190569个核和265701个核的基因表达图谱。并通过分别对水稻和高粱的22154和20169个细胞核进行测序，检测了光照后0h和12 h染色质可及性的细胞特异性变化。

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进行聚类分析后，为每个物种识别出了19个不同的亚群。利用已发表的标记基因及同源基因的内容，为每个亚群进行了细胞注释，分别归属于叶肉细胞、保卫细胞、表皮细胞、木质部薄壁组织细胞和韧皮部细胞。GO富集分析中鉴定到的Terms与细胞的生物学功能是一致的。例如叶肉核中参与光合作用的基因高表达，表皮细胞核簇中含有参与脂质生物合成和输出的基因富集，这与该组织在角质产生中的作用一致。

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为了更进一步鉴定高粱维管束鞘细胞，作者通过NADP-malic酶（NADP-ME）和甘氨酸脱羧酶（GDC）等C4基因的表达进行细胞亚群确定。而水稻中缺失相关的标记基因，因此选择mTurguoize2报告基因标记维管束鞘细胞驱动表达。在对一个富含维管束鞘核的水稻叶核群体进行转录组测序，发现了14个簇，其中mTurguoize2报告基因的表达确定了水稻维管束鞘。在同一个亚群中，也鉴定到了已经被证明在成熟水稻叶片的维管束鞘细胞中表达的基因，例如PLASMA MEMBRANE INTRINSIC PROTEIN (PIP1.1) 和SULFITE REDUCTASE (SIR)。因此利用这个聚类中的标记基因，可以在去黄化数据集中鉴定维管束鞘细胞。

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为了对细胞类型基因表达图谱更进一步的解析，结合scRNA-seq和scATAC-seq联合分析后，在每个物种中鉴定出6种细胞类型，并显示在每种细胞类型特有的基因启动子区域有可及性区域。这些峰附近的基因具有与已知细胞功能相关的富集terms。总之，这些数据为了解谷类作物中与光合作用诱导相关的基因表达和染色质可及性的变化提供了细胞水平的研究基础。

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维管束鞘细胞在解析

为了解析水稻和高粱中每种细胞类型的转录特性，作者又构建了一个光照48小时后样本的细胞图谱。由于物种之间存在差异，但是可以发现不同来源的细胞大部分可以聚集在一起。最明显的作者发现维管束鞘细胞的细胞核，来自高粱的细胞核与来自水稻的维管束鞘细胞核明显聚集在一起。两个物种中仅有31个同源基因（在229个水稻维管束鞘标记中）的转录本明显在两个物种中有对应关系，这些基因参与硫代谢和转运。通过对同源基因的解析，作者发现高粱的维管束鞘细胞在转录上更类似于水稻的叶肉细胞和保卫细胞，而水稻的维管束鞘细胞与高粱的韧皮部最为相似。

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C4植物维管束鞘的光调节

因为光诱导光形态建成，作者探究细胞水平上应对光调控的表达变化，发现水稻叶肉细胞和高粱维管束鞘细胞核按时间聚集在一起，表明光是转录变化的主要驱动原因。多个标记基因的表达水平出现明显的诱导变化，例如基因RBCS 和NADP-ME。

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光诱导的典型光合作用基因在叶肉之间的叶肉和维管束鞘细胞之间差距较大。例如，在水稻中，大部分光合调控基因在在叶肉中被激活，但是其他细胞组织的表达水平比较微弱。扫描电镜证实，在黑暗中，叶黄体存在维管细胞和表皮细胞中，光照后，类囊体结构非常明显。以上结果表明调控光合作用的细胞类型中可以被轻微地诱导。在高粱中，光强烈诱导了光合作用基因在叶肉细胞和维管束鞘细胞中的响应，这些基因包括对光反应重要的基因合成以及卡尔文-本森-巴舍姆和C4循环基因。这些在叶肉细胞的染色质可及性也受到了光的诱导。这些数据表明了在C4植物中参与光调控的基因可能通过调控维管束鞘细胞并促进染色质可及性的丰度。

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C4植物含有一个祖先的顺式元件

顺式调控元件在驱动基因表达模式中起着关键作用。作者通过比较不同物种中每种细胞类型的25个最显著富集的顺式调节motif，去检索两个物种中保守的顺式调控元件，在两种物种的维管束鞘和韧皮部特异性峰中富集到DOF基序。同时作者在其余几个C3禾草科物种的水稻和高粱束鞘同源基因的启动子区域检测到DOF基序富集，例如 Chasmanthium laxum、Hordeum vulgare 和 Brachypodium distachyon。同时作者也发现了一些响应光调控的顺式元件，例如bZIP和CCA1基序。以上研究结果表明细胞类型特异性的基因表达模式是由细胞识别的顺式元件定义的，而光响应基因的表达是由所有细胞类型共享的相似的顺式元件调控的。

接下来，作者研究了与每种细胞类型相关的顺式编码是否调控了水稻和高粱之间差异分配的基因。值得注意的是，在这些差异基因中，发现相关染色质在水稻叶肉特异性基因的细胞类型Myb-related、high-mobility group (HMG)、REVEILLE 5 (RVE5) 和DF1中富集，但在高粱中维管束鞘细胞的特异可及性区域中富集到了DOF和JACKDAW（JKD）或不定域（IDD）结合位点。这表明，这些同源基因通过改变与身份相关的顺式调节基序，改变了它们从叶肉到维管束鞘细胞的分配。总的来说DOF基序是通过交换表达从C3水稻的叶肉到C4高粱的维管束鞘的基因发挥功能。随后作者也通过试验验证获得了一致的结果，以上结果表明(i)水稻和高粱中具有一致的叶肉和维管束鞘特异性顺式元件；（ii）两种物种之间的转录因子模式相对保守；（iii）高粱维管束鞘中表达的光合作用基因与富集到与水稻维管束鞘细胞相关的DOF顺式元件，进而这类细胞类型中的表达水平升高。

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